[發明專利]一種檢測裂谷熱病毒的引物和探針

在審

• 申請號: 201510468141.0
• 申請日: 2015-07-31
• 公開（公告）號: CN105002302A
• 公開（公告）日: 2015-10-28
• 發明（設計）人: 李林;吳曉東;劉春菊;鄒艷麗;王華;王清華;王志亮
• 申請（專利權）人: 中國動物衛生與流行病學中心
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

技術領域

本發明屬于獸醫病原微生物檢測技術領域，具體涉及一種檢測裂谷熱病毒的引物組和探針。即應用重組酶聚合酶等溫擴增技術(Recombinase?Polymerase?Amplification，RPA)技術檢測裂谷熱病毒所用到的引物及檢測方法。

背景技術

裂谷熱(Rift?valley?fever，RVF)是由裂谷熱病毒(Rift?valley?fever?virus,RVFV)引起反芻動物和人發病的人獸共患病。裂谷熱病毒可以通過蚊子或接觸血液、體液、組織或患病動物而傳播。本病對綿羊、山羊、牛的影響較為嚴重，可引起懷孕動物的流產和新生畜的死亡。大齡非懷孕動物也較易感，但臨床抗病性較強，動物的易感性與其本身的遺傳差異有關，來自非洲以外及RVF非流行地區的動物對本病較易感。人對RVFV易感，可通過接觸、處理感染性材料或通過蚊蟲媒介叮咬感染，人感染后通常無癥狀或者與主要的自身限制性的發熱疾病相關。經過2－5天的潛伏期之后，病人可能經歷一個流感樣的疾病，伴隨無顯著特點的疲勞，低燒，頭疼，畏光和關節疼痛。一些病人發展為昏倒。大量有癥狀的病人將呈現肝炎。發熱通常持續一周，大部分自然康復，少于5％的病人將發展為綜合征如腎炎、出血熱或者腦炎，死亡率高達10－12％。

裂谷熱主要在西非和其他一些非洲國家呈地方性流行，在強降雨后牲畜和人群中周期性流行。2000年病毒被傳播到阿拉伯半島，引起沙特和也門的疫情大暴發，這也是該病第一次被傳播到在非洲大陸以外的地方，提示該病進一步擴散到其他地區的可能性進一步增大。目前已經建立了幾種實時熒光RT-PCR方法來檢測該病，但這些方法普遍需要高昂的儀器設備，并且無法滿足田間檢測的需要。為快速對裂谷熱做出診斷，急需建立一種使用易讀取系統基礎之上的高靈敏性和特異性的實時檢測方法。

發明內容

本發明的目的是提供一種應用RPA技術檢測裂谷熱病毒的引物及探針，從而彌補現有技術的不足。

本發明的引物及探針，其正向引物的序列為SEQ?ID?NO：1，反向引物序列為SEQ?ID?NO：2所示，探針序列為SEQ?ID?NO：3所示。

其中探針RVFV-RPAp中的第27個堿基標記BHQ1淬滅基團修飾，第28位堿基替換為四氫呋喃(tetrahydrofuran)，第29位堿基標記FAM發光基團修飾，3′末端進行磷酸化修飾。

本發明的引物及探針用于檢測裂谷熱病毒；

本發明還提供了一種通過重組酶聚合酶等溫擴增技術檢測裂谷熱病毒的方法：提取待檢樣品中的RNA作為模板，利用所述的引物和探針進行熒光快速檢測，如果有明顯的熒光曲線擴增，則說明所檢測樣品中含有裂谷熱病毒核酸。

本發明根據裂谷熱病毒基因組序列設計了大量RPA引物和探針，從中篩選出可快速有效檢測裂谷熱病毒核酸的引物及探針組合。利用該套引物和探針進行快速檢測，以體外轉錄的裂谷熱病毒核酸RNA作為陽性對照可以得到明顯的擴增曲線，其他病原核酸如口蹄疫病毒、羊傳染性膿皰病毒、山羊支原體和藍舌病病毒為模板進行反應均沒有擴增曲線。

附圖說明

圖1為裂谷熱病毒特異性檢測，其中1為裂谷熱病毒陽性對照，2-6分別為口蹄疫病毒、羊傳染性膿皰病毒、山羊支原體、藍舌病病毒和健康羊淋巴結。

圖2為檢測靈敏度試驗圖，使用體外轉錄的RVFV?RNA為模板，拷貝數從10⁶到10⁰低依次的檢測陽性率。

具體實施方式

本發明通過對RVFV毒株進行序列比對后，獲得病毒保守性較高的區域，然后從該區域設計引物及探針。所使用的引物和探針若檢測出特異性熒光曲線則為RVFV毒株。

下面通過具體實施方式的詳細描述進一步闡明本發明。對于本發明具體實施例中所采用的方法步驟，本領域的普通技術人員可以從現有技術中進行選擇替換，而并不僅限于本發明的具體記載。

實施例1：RPA檢測RVFV方法的建立

根據GenBank中裂谷熱病毒基因組序列，設計引物和探針。引物長度約為30-35nt，由于目前沒有針對RPA的引物設計軟件，本發明前期工作過程中設計合成了大量引物，從中篩選出一對靈敏度高且特異性好的引物，引物和探針序列SEQ?ID?No.1、SEQ?ID?No.2、和SEQ?ID?No.3(表1)。

表1：用于RPA檢測RVFV的引物和探針