[發(fā)明專利]一種用于檢測微核糖核酸的熒光傳感器的制備方法及應(yīng)用

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• 申請日: 2015-07-31
• 公開（公告）號: CN105158221A
• 公開（公告）日: 2015-12-16
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張毅;段宏泉
• 申請（專利權(quán)）人: 天津醫(yī)科大學(xué)
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;C12Q1/68
• 代理公司: 天津佳盟知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 12002
• 代理人: 侯力

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及化學(xué)合成技術(shù)及生化分析檢測技術(shù)領(lǐng)域，特別是一種用于檢測微核糖核酸的熒光傳感器的制備方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)

微核糖核酸(miRNAs)是一類由內(nèi)源基因編碼的、長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，它在細(xì)胞分化、增殖和凋亡以及腫瘤的發(fā)生和發(fā)展等病理過程中都起到非常重要的調(diào)控作用。有研究表明，某些miRNAs可以介導(dǎo)腫瘤的擴(kuò)增和擴(kuò)散，與多藥耐藥密切相關(guān)，可以調(diào)節(jié)癌癥轉(zhuǎn)移過程中多個基因的表達(dá)，這些miRNAs很有可能成為預(yù)測癌癥的重要指標(biāo)，例如：hsa-miR-122在肝癌的發(fā)生與發(fā)展中扮演著重要的角色。目前，miRNAs的檢測手段主要包括反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)、微陣列、電化學(xué)、熒光法等。其中，相比其他三種方法，熒光法具有成本低廉、靈敏度高、操作簡單等明顯優(yōu)勢。

熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)是在熒光供體的激發(fā)狀態(tài)下由一對偶極子介導(dǎo)的能量從供體向受體轉(zhuǎn)移的非輻射過程。FRET受體和供體之間依靠生物偶聯(lián)作用相結(jié)合時，彼此間距只有幾個納米，二者之間的能量轉(zhuǎn)移過程可以通過掃描供體和受體的熒光光譜得以檢測。FRET效率對因目標(biāo)分子濃度變化引起的受體-供體間距在納米尺度的差異具有優(yōu)越的靈敏度，因此，近年來在生物分析領(lǐng)域，尤其是在核酸雜交的檢測中，F(xiàn)RET技術(shù)發(fā)揮了巨大的作用。然而，目前FRET技術(shù)普遍應(yīng)用的有機小分子熒光供體光漂白嚴(yán)重；而且，基于穩(wěn)態(tài)熒光的傳統(tǒng)FRET分析中，當(dāng)以紫外光激發(fā)時，生物樣本的自發(fā)熒光干擾十分嚴(yán)重。

時間分辨型FRET生物傳感器選擇具有長壽命的熒光發(fā)光團(tuán)(如稀土配合物或稀土摻雜納米粒子)，在檢測時設(shè)置較長的延遲時間(delaytime，如100μs)，能夠有效地避免短壽命自發(fā)熒光干擾(一般為ns級)，有利于提高miRNAs的檢測靈敏度。稀土摻雜納米粒子是一類新興的熒光傳感器材料，與有機染料和半導(dǎo)體量子點相比，它有很多更優(yōu)越的光學(xué)和化學(xué)性質(zhì)，例如：熒光壽命長、耐光漂白能力強、有效斯托克斯(Stokes)位移大、發(fā)射峰狹窄以及生物毒性低。由于稀土摻雜納米粒子適用于時間分辨熒光檢測技術(shù)，因此，有望將此材料應(yīng)用于非侵襲性、無損傷實時疾病監(jiān)測。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有微核糖核酸熒光傳感器的缺點與不足，提供一種用于檢測微核糖核酸的熒光傳感器的制備方法及應(yīng)用，用于靈敏、特異地檢測hsa-miR-122-5p。

本發(fā)明的技術(shù)方案：

一種用于檢測微核糖核酸的熒光傳感器的制備方法，包括以下步驟：

1)通過溶劑熱法制備聚丙烯酸(PAA)修飾的GdF₃:Tb³⁺納米粒子

在17-18.2MΩcm的超純水與乙二醇混合溶劑中加入GdCl₃·6H₂O、聚丙烯酸和TbCl₃·6H₂O，攪拌至均勻透明后加熱至50℃得到溶液a；另在超純水與乙二醇混合溶劑中加入NH₄F，室溫攪拌至均勻透明后加熱至50℃得到溶液b，趁熱將溶液b以每秒1滴的滴加速度滴加到溶液a中，反應(yīng)20-60min后，2000rpm離心5min收集固體產(chǎn)物，并分別用超純水和乙醇各洗滌兩遍，真空干燥8-10小時，得到聚丙烯酸修飾的GdF₃:Tb³⁺納米粒子白色粉末狀產(chǎn)物；

2)利用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺(EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)催化縮合制備偶聯(lián)有寡核苷酸單鏈probeI的GdF₃:Tb³⁺納米粒子溶液