[發明專利]改良凝膠電泳檢測血清前β1高密度脂蛋白的方法和應用

有效

• 申請號: 201510466708.0
• 申請日: 2015-08-03
• 公開（公告）號: CN105137070B
• 公開（公告）日: 2018-07-24
• 發明（設計）人: 陳允欽;張曉金
• 申請（專利權）人: 復旦大學附屬中山醫院
• 主分類號: C07K1/26
• 分類號: C07K1/26
• 代理公司: 北京英賽嘉華知識產權代理有限責任公司 11204
• 代理人: 王達佐;洪欣

本發明涉及一種采用非線性梯度凝膠電泳精準分離和定量分析血清preβ1?HDL的方法。本發明優點在于：本發明的非線性濃度梯度獨立分層的制備過程簡單易行，不需要特殊混合裝置；實施電泳僅需≤3.5h；定量方法無需放射性物質。本發明建立的非線性梯度凝膠電泳能夠精準檢測preβ1?HDL，在性能上具有明顯的優越性，并且是目前唯一可行的方法。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體地說，是改良凝膠電泳檢測血清前β1高密度脂蛋白的方法和應用。

背景技術

血清前β1高密度脂蛋白(preβ1-HDL)是一種新生的HDL，在膽固醇逆轉運過程中發揮著重要功能，具有抗動脈粥樣硬化的作用。但是令人費解的是，臨床資料顯示preβ1-HDL在冠心病患者中的含量顯著升高，而不是負相關的關系。問題的關鍵在于方法學存在缺陷，以往應用的梯度凝膠電泳(GGE)是以線性濃度梯度為基礎，結果不能區分游離的載脂蛋白Apo A1，因此不能準確檢測preβ1-HDL。

以往線性GGE應用于二維凝膠電泳，聯合免疫印跡技術檢測preβ1-HDL。美國波士頓Tufts大學的Asztalos建立的方法發表于1993年，后來廣為所用。經Boston HeartDiagnostics公司開發用于Boston Heart HDL 的核心技術。20余年來該項技術的應用帶來經濟效益，同時影響本領域學術界對preβ1-HDL的認識，以致成為本行業內公認的經典。然而，2014年Miyazaki報道兩維電泳技術檢測的preβ1-HDL實質是一種游離的Apo A1單體。顯而易見，因為無法區分游離的Apo A1，該項技術存在致命缺陷，長期以來對于preβ1-HDL的認識一直存在概念上的混淆，導致錯誤地認為具有保護作用的preβ1-HDL的含量在冠心病患者中反而顯著升高。另外，線性梯度的凝膠(如2％-36％)在制備中需要特殊的混合裝置，穩定性也不如非線性梯度的設置。實施電泳時間往往要24h。定量方法應用¹²⁵I，需要嚴格的放射性實驗條件。由此可見，工序復雜，操作耗時，且無法避免放射性問題，成為該法難以克服的缺點。參考：http://www.bostonheartdiagnostics.com/science_portfolio_map_test.php。

發明內容

本發明的目的是針對現有技術中的不足，提供非線性梯度凝膠和/或蘇丹黑B染色液在精準分離和定量分析血清preβ1-HDL中的應用。

本發明的第二個目的是，提供一種精準分離和定量分析血清preβ1-HDL的方法。

為實現上述目的，本發明采取的技術方案是：非線性梯度凝膠和/或蘇丹黑B染色液在精準分離和定量分析血清preβ1-HDL中的應用，所述的非線性梯度凝膠是由三段濃度依次為3.0％、3.6％和7.0％的聚丙烯酰胺凝膠共同組成，所述的蘇丹黑B染色液中蘇丹黑B的濃度為0.5-1.0w/v％，溶劑異丙醇和乙二醇的體積比為4:1。

所述的非線性梯度凝膠分別作為一維非線性梯度管狀凝膠體系和二維非線性梯度平板凝膠體系分離血清preβ1-HDL的電泳介質，所述的一維非線性梯度管狀凝膠體系分離蘇丹黑B預染色的血清preβ1-HDL。

為實現上述第二個目的，本發明采取的技術方案是：一種精準分離和定量分析血清preβ1-HDL的方法，采用非線性梯度凝膠精準分離和定量分析血清preβ1-HDL，其中非線性梯度凝膠是由三段濃度依次為3.0％、3.6％和7.0％的聚丙烯酰胺凝膠共同組成。

所述的非線性梯度凝膠分別作為一維非線性梯度管狀凝膠體系和二維非線性梯度平板凝膠體系分離血清preβ1-HDL的電泳介質。

采用一維非線性梯度管狀凝膠體系分離蘇丹黑B預染色的血清preβ1-HDL，所述的蘇丹黑B染色液中蘇丹黑B的濃度為0.5-1.0w/v％，溶劑異丙醇和乙二醇的體積比為4:1。