[發明專利]一種鑒別鯉魚品種的分子標記及利用其進行鑒別的方法

在審

• 申請號: 201510436129.1
• 申請日: 2015-07-22
• 公開（公告）號: CN104946787A
• 公開（公告）日: 2015-09-30
• 發明（設計）人: 董在杰;曲疆奇;朱文彬;王蘭梅
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院淡水漁業研究中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所(普通合伙) 32104
• 代理人: 殷紅梅;張仕婷

技術領域

本發明涉及一種鑒別鯉魚品種的分子標記及利用其進行鑒別的方法，屬于分子標記技術領域。

背景技術

鯉魚是我國最主要的淡水養殖品種之一，養殖品種眾多，目前已獲得水產新品種證書的鯉魚品種就多達20多種。在區分不同鯉魚品種的時候，往往是根據形態學特征，如體色或是體長、體高、側線鱗、鰭條等可數性狀和可量性狀進行鑒別，但這些表型性狀的數值，在不同的鯉魚品種中都有部分重疊，以至于無法準確地判別不同品種。

分子標記是以個體間遺傳物質內核苷酸序列變異為基礎的遺傳標記，是DNA水平遺傳多態性的直接的反映。其中，目標區域擴增多態性(target?region?amplified?polymorphism,TRAP)也叫靶位區域擴增多態性，是一種基于PCR的新型分子標記技術。TRAP技術是利用生物信息學工具和表達序列標簽數據庫信息，通過對目標候選基因區域的PCR擴增，產生圍繞目標候選基因序列的多態性標記。是一種與性狀相關聯的分子標記。

發明內容

本發明的目的是克服形態學特征無法準確鑒別鯉魚品種的不足，提供一種TRAP分子標記及其獲得方法，有助于快速、準確鑒別福瑞鯉與其原始親本——建鯉和黃河鯉，在鯉魚選育、種質資源鑒定、保護和利用中有極大的應用價值。

按照本發明提供的技術方案，一種鑒別鯉魚品種的分子標記，采用的引物對為：核苷酸序列為5’-3’；固定引物序列為：5’-GCCGACTTGAAAATGG-3’，隨機引物序列為：5’-GGAACCAAACACATGAAGA-3’。

采用所述分子標記進行鯉魚品種鑒別的方法，步驟為：

(1)設計TRAP分子標記引物：設計固定引物序列和隨機引物序列；

(2)PCR反應：總體積為15μL，其中Mg²⁺1.5mmol/L、dNTPs0.35mmol/L、隨機引物6pmol/L、固定引物10pmol/L、含DNA模板60ng、Taq?DNA聚合酶1.0U，用滅菌雙蒸餾水補足體積；

PCR反應條件為：94℃4min；94℃45s，35℃45s，72℃1min，5個循環；94℃45s，53℃45s，72℃1min，35個循環；72℃10min；

(3)電泳：對步驟(3)的所得PCR產物用質量濃度為8.0％的聚丙烯酰胺凝膠進行電泳分離，銀染法染色后，拍照記錄電泳結果；

(4)結果觀察：針對特定鯉魚品種電泳后樣品出現電泳條帶，用于鯉品種鑒別、保種和分子輔助選擇育種。

本發明的有益效果：本發明提供的引物對在針對福瑞鯉樣本中，擴增出一條200bp左右的明顯特異條帶，而原始親本建鯉和黃河鯉中并無此條帶，通過該分子標記可廣泛用于鯉魚品種鑒別、保種和分子輔助選擇育種。

附圖說明

圖1是實施例1福瑞鯉的特異TRAP標記示意圖(箭頭所示)。

圖2是實施例2福瑞鯉的特異TRAP標記示意圖(箭頭所示)。

圖3是實施例3福瑞鯉的特異TRAP標記示意圖(箭頭所示)。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發明作進一步說明。

實施例1

福瑞鯉及其原始親本——建鯉和黃河鯉均取自中國水產科學研究院淡水漁業研究中心宜興實驗基地，每種魚隨機各取10尾。剪取每尾魚的鰭條抽提基因組DNA。

選擇可能與鯉魚生長性狀相關的GH(GenBank?accession?no.M27000.1)，GHR(AY741100.1)，IGF(D83272.1)，TRH(AB179818.1)and?GTH(X56497.1)基因作為目標候選基因，設計18個固定引物。針對外顯子或內含子的特點，設計了4個富含GC或AT核心區的隨機引物，依據Hu(2006)文獻設計合成。具體如表1所示。

以所取基因組DNA為模板，用18個固定引物分別與4個隨機引物組合進行PCR擴增，引物具體如表1所示。

PCR反應總體積為15μL，其中Mg²⁺1.5mmol/L、dNTPs0.35mmol/L、隨機引物6pmol/L、固定引物10pmol/L、含DNA模板60ng、Taq?DNA聚合酶1.0U，用滅菌雙蒸餾水補足體積。PCR反應條件為：94℃4min；94℃45s，35℃45s，72℃1min，5個循環；94℃45s，53℃45s，72℃1min，35個循環；72℃10min。