[發(fā)明專利]一種磁性納米復合顆粒的制備方法及其應用

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• 申請日: 2015-07-23
• 公開（公告）號: CN105107473A
• 公開（公告）日: 2015-12-02
• 發(fā)明（設計）人: 孫俊;馬海樂;徐斌;蔣蒙蒙
• 申請（專利權）人: 江蘇大學
• 主分類號: B01J20/26
• 分類號: B01J20/26;B01J20/22;B01J20/28;B01J20/30;C12N9/36
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技術領域

本發(fā)明涉及納米材料的制備和生物活性物質分離純化技術領域，特別涉及一種以Fe₃O₄為核，以天然生物高分子多糖或檸檬酸為殼的一種磁性納米復合顆粒的制備及其從蛋清中一步法快速分離純化溶菌酶的方法。

背景技術

溶菌酶（Lysozyme，EC3.2.1.17）是一種專門作用于微生物細胞壁的水解酶，具有殺菌和破壁的作用，是一種有效的抗菌劑。溶菌酶應用范圍較為廣泛，在食品、醫(yī)藥、生物以及飼料工業(yè)等領域均發(fā)揮著重要作用。近年來，在國內外市場，溶菌酶是一種非常緊俏的生物活性物質。

迄今，實際應用的已經(jīng)商品化的大多為雞蛋蛋清溶菌酶，它也是構效了解最清楚的溶菌酶之一，因此雞蛋蛋清是分離純化溶菌酶的主要原料。目前，已報道的溶菌酶的分離純化方法主要有鹽析法、結晶法、超濾法、樹脂吸附法等。如孫維軍等（參見CN101768577A）從禽蛋中提取溶菌酶時，采用酶法提取、分離、冷凍、離心、超濾得到溶菌酶。郭順堂等（參見CN101619308A）從雞蛋蛋清中提取溶菌酶時，則采用了均質、離子交換層析，超濾等步驟獲得了溶菌酶。王蘇南（參見CN1844379A）在從蛋清中分離純化溶菌酶時采用了蛋清先用樹脂吸附，之后鹽水浸泡，結晶，一次壓濾，溶解，二次壓濾，超濾及三次壓濾等步驟才獲得了較高活性的溶菌酶。以上純化方法均較為復雜，操作繁瑣，在多次工藝處理過程易造成蛋清中的蛋白質變性；另外，所使用的超濾法生產(chǎn)成本較高，需要特殊昂貴的設備，同時蛋清也必須用磷酸鹽緩沖溶液稀釋10倍及以上，使蛋清蛋白質難以回收利用；盡管離子交換層析法目前在溶菌酶的分離純化上應用較為廣泛，然而由于其設備復雜，操作步驟繁瑣，后處理容易造成環(huán)境污染，同時在提取過程中引入了硫酸銨，產(chǎn)品不適用于食品醫(yī)藥行業(yè)，因此使其大規(guī)模工業(yè)化應用受到一定的限制。

尋找新的溶菌酶分離純化技術，以降低生產(chǎn)成本，精簡操作工序，提高溶菌酶產(chǎn)品的純度及活性，就成為許多科研工作者正待解決的課題。以磁性納米顆粒為吸附載體對生物活性物質進行分離純化是一項新興的分離純化技術，通過對磁性納米顆粒的表面修飾改性，特定地分離純化目標物質，在外加磁場的作用下，從復雜的體系中實現(xiàn)快速分離。與傳統(tǒng)方法相比，磁性納米分離技術具有操作簡單、快速、高效富集、高回收率等優(yōu)點。

蛋清中溶菌酶由129個氨基酸殘基構成，由于其中含有較多的堿性氨基酸殘基，所以其等電點高達10.8左右，是蛋清中唯一的堿性酶。而溶菌酶常溫下在中性鹽溶液中具有較高天然活性，在中性條件下溶菌酶帶正電，因此可以利用靜電相互作用力分離純化蛋清中的溶菌酶。本專利就是利用蛋清中溶菌酶這一獨特性質，結合了傳統(tǒng)的強陽離子交換樹脂和磁性納米分離技術的優(yōu)點。

本發(fā)明選擇Fe₃O₄為磁核，主要是因為Fe₃O₄磁性納米顆粒毒性較低，制備方法簡單，當粒徑小于30nm時，則表現(xiàn)出超順磁性，即在外加磁場作用下具有較強的磁響應性，當撤離磁場時，磁性迅速消失，剩磁為零，不會被永久磁化。本發(fā)明采用超聲波輔助的化學共沉淀法制備合成了形貌規(guī)整，粒徑均一的超順磁性納米復合顆粒，并將其應用于蛋清中溶菌酶的一步法快速分離純化。

發(fā)明內容

本發(fā)明要解決的關鍵技術問題在于克服傳統(tǒng)溶菌酶分離純化方法的不足之處，提供一種磁性納米復合顆粒的制備及其應用于蛋清中溶菌酶的快速分離純化方法，制備的顆粒形貌規(guī)整、粒徑均一、磁響應性強，表面功能基團豐富，具有良好的生物相容性和水分散性。采用所制備的磁性納米復合顆粒分離純化雞蛋蛋清中的溶菌酶，操作簡便、成本低廉，生產(chǎn)周期短，分離效率高，分離得到的溶菌酶具有較高的活性，同時工藝易于放大進行大規(guī)模化生產(chǎn)溶菌酶，解決了傳統(tǒng)溶菌酶分離工藝復雜、步驟繁多等問題。

本發(fā)明提供的一種磁性納米復合顆粒的制備方法及其應用，具體實施方案如下：

1、磁性納米復合顆粒的制備

采用超聲波輔助的化學共沉淀法合成，化學反應方程式為：

Fe²⁺+2Fe³⁺+8NH₃·H₂O=Fe₃O₄↓+8NH⁴⁺+4H₂O

一種磁性納米復合顆粒的制備方法，按照下述步驟進行：