[發明專利]透明質酸修飾單壁碳納米管制備診斷治療的還原敏感性藥物納米劑的方法及應用

有效

• 申請號: 201510432004.1
• 申請日: 2015-07-21
• 公開（公告）號: CN104940959B
• 公開（公告）日: 2017-11-14
• 發明（設計）人: 侯琳;楊曉敏;張振中;王用超;任俊曉;石宇洋;馮倩華;袁玉潔;單曉寧;張媛媛
• 申請（專利權）人: 鄭州大學
• 主分類號: A61K49/12
• 分類號: A61K49/12;A61K49/18;A61K9/14;A61K47/61;A61K31/704;A61P35/00
• 代理公司: 鄭州天陽專利事務所(普通合伙)41113
• 代理人: 聶孟民

1.一種透明質酸修飾單壁碳納米管制備診斷治療的還原敏感性藥物納米劑的方法，其特征在于，由透明質酸修飾后的單壁碳納米管通過3，3’-二硫代二丙酸作為連接臂和阿霉素相連，然后將三氯化釓吸附到單壁碳納米管上，再用表面活性劑分散形成用透明質酸修飾的單壁碳納米管，用于診斷治療的還原敏感性藥物的納米制劑；所述透明質酸為分子量大于等于600道爾頓且小于等于400 kd的低分子量透明質酸；所述單壁碳納米管的長度為1～3μm、直徑為1～2nm；所述連接臂為碳原子數2～12的3,3’-二硫代二丙酸或辛二酸；所述3,3’-二硫代二丙酸中的二硫鍵具有還原敏感性，在腫瘤細胞高濃度的谷胱甘肽作用下迅速斷裂釋放藥物，由以下步驟實現：

（1）羧化碳管與氨化透明質酸連接：

稱取25～75mg羧化碳管于15～45ml反應溶劑的燒杯中，冰浴探超15～45min，成羧化碳管溶液；稱取氨化透明質酸60～120mg溶于5-15ml的溶劑中，成氨化透明質酸溶液；稱取EDC 120～240mg、NHS 80～160mg，用1～7ml溶劑渦旋溶解，加入到羧化碳管溶液中，攪拌室溫反應5～25min，成羧化碳管混合溶液；在氨化透明質酸溶液中加入三乙胺100～260μl，然后將氨化透明質酸和三乙胺的混合溶液快速滴加至羧化碳管混合溶液中，室溫反應8～40h，加入3～4倍體積預冷的丙酮，冷卻析晶，過濾，丙酮洗滌沉淀，得沉淀物，沉淀物用水復溶，透析2d，凍干；

所述的溶劑為水、甲酰胺、或N,N-二甲基甲酰胺與水、或甲酰胺與水、或N,N-二甲基甲酰胺與甲酰胺的混合溶劑；

所述的氨化透明質酸是，將透明質酸95-105mg、1- 乙基-(3- 二甲基氨基丙基) 碳二亞胺鹽酸鹽254-264mg 和N- 羥基琥珀酰亞胺150-160mg，溶解在8-12ml 的有機溶劑中，室溫攪拌30 min，得反應液，將反應液緩慢滴入0.4-0.6ml 乙二胺的甲酰胺溶液中，冰浴滴加1h，升至室溫反應6-48h，加入50ml 丙酮沉淀，抽濾，得沉淀物，沉淀物加水復溶，透析2d，冷凍干燥，即得氨化透明質酸，有機溶劑為甲酰胺、N,N- 二甲基甲酰胺、二甲基亞砜的一種；

（2）制備SWCNTs-HA-ss-COOH：

取500～1500mg碳原子數2～12的3,3’-二硫代二丙酸或辛二酸為連接臂，溶解于反應溶劑中，EDC 500～1500mg、NHS 200～1000mg分別渦旋溶解于反應溶劑中，將上述溶液混合攪拌活化5～25min，成活化溶液；將HA-SWCNTs 50～350mg超聲溶解，與活化溶液混合，室溫條件下攪拌1～8h，所得產物通過丙酮冰浴析晶，過濾，收集沉淀，沉淀用水復溶，透析2d，除去多余的3,3'-二硫代二丙酸、EDC、NHS鹽，凍干，成SWCNTs-HA-ss-COOH，4℃保存；

所述的反應溶劑為水、或甲酰胺、或N,N-二甲基甲酰胺與水、或甲酰胺與水、或N,N-二甲基甲酰胺與甲酰胺的混合溶劑；

（3）SWCNTs-HA-ss-COOH與DOX連接成SWCNTs-HA-ss-DOX：

取1～8mg DOX?HCL溶解于500～1500μl的pH為7～10的PBS溶液中，成第一溶液；稱取2～15mg的SWCNTs-HA-ss-COOH超聲溶解于200～800μl反應溶劑，成第二溶液，將兩種溶液混合在一起反應1～4h，成混合液；取10～60mg鹽酸羥胺溶解于200～2000μl的pH為7～10的PBS溶液中，加入混合液中反應0.5～5h，得產物，產物用超純水透析2d后，凍干，成SWCNTs-HA-ss-DOX；

所述的反應溶劑為二氯亞砜、或N,N-二甲基甲酰胺、或二氯亞砜與N,N-二甲基甲酰胺的混合溶劑；

（4）Gd的負載：

5～10mg的SWCNTs-HA-ss-DOX加入到水中，在冰浴中超聲5～60min分散，離心棄去未分散的沉淀，成單壁碳納米管混懸液；室溫磁力攪拌條件下將50～80mg的GdCl₃粉末溶于水中，滴加到分散均勻的單壁碳納米管混懸液中，產生絮狀沉淀，即成Gd/SWCNTs-HA-ss-DOX；

（5）制備Gd/SWCNTs-HA-ss-DOX藥物納米劑：

將步驟（4）含有絮狀沉淀的混合物離心2～30min，棄去上清液得沉淀，在沉淀中加入表面活性劑溶液，冰浴超聲5～55min分散，然后離心2～25min，棄去沉淀，上清液透析10-16h，再離心2～30min，棄去沉淀，即得透明質酸修飾單壁碳納米管制備診斷治療的還原敏感性藥物納米劑；

所述的表面活性劑為大豆卵磷脂，或大豆卵磷脂與泊洛沙姆的混合物，表面活性劑溶液是由每10mg的表面活性劑加入1ml的水制成。