[發(fā)明專利]一種可視化多色檢測抗原?抗體反應(yīng)試劑盒及使用方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510430364.8
• 申請日: 2015-07-21
• 公開（公告）號: CN105067803B
• 公開（公告）日: 2017-04-12
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李根喜;李超;吳丹;衛(wèi)璐明;黎天琪
• 申請（專利權(quán)）人: 南京大學
• 主分類號: G01N33/53
• 分類號: G01N33/53
• 代理公司: 南京知識律師事務(wù)所32207
• 代理人: 胡錫瑜

一、技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于免疫分析和診斷技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種可視化多色檢測抗原-抗體反應(yīng)試劑盒及使用方法。

二、背景技術(shù)

酶聯(lián)免疫吸附實驗是將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面，使酶標記的抗原抗體反應(yīng)在固相表面進行的技術(shù)。該技術(shù)可用于檢測大分子抗原和特異性抗體等，具有反應(yīng)快速，檢測靈敏，操作簡便，使用成本低廉，載體易于標準化等優(yōu)點。

雖然酶聯(lián)免疫吸附實驗有諸多優(yōu)點，但是由于需要使用酶標記的抗體來實現(xiàn)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與輸出，導(dǎo)致其每次只能單色的檢測一種物質(zhì)，極大地限制了檢測效率，而且使用的酶如辣根過氧化物酶，堿性磷酸酶等易受到微生物或體內(nèi)內(nèi)源性氧化物酶或外源酶抑制劑(如疊氮化鈉)的干擾，容易帶來假陽性或假陰性的結(jié)果。最后，在低濃度目標分子存在下，往往需要20分鐘以上的時間才可以讀出可靠的結(jié)果，進一步延長了反應(yīng)所需的時間。因此，現(xiàn)在存在對操作反應(yīng)簡單、體系穩(wěn)定、可同時檢測、靈敏度好，響應(yīng)快速的免疫標記和檢測技術(shù)的需求。

目前，利用納米材料開發(fā)可同時檢測多種抗原的免疫檢測方法是當前開發(fā)新型免疫傳感器的一個熱門方向，例如，F(xiàn)an小組報道了一種基于量子點的微流控平臺來同時檢測兩種腫瘤標志物的方法，其利用的主要是微流控技術(shù)和具有不同發(fā)射光的量子點納米顆粒(參考文獻：Hu,M.；Yan,J.,He,Y.；Lu,H.,Weng,L.,Song,S.；Fan,C.,Wang,L.AcsNano,2010,4,488-494)；Wang小組報道了一種利用磁納米顆粒的多通道微芯片來實現(xiàn)同時檢測多種疾病標志物(參考文獻：Gaster,R.S.,Hall,D.A.；Nielsen,C.H.,Osterfeld,S.J.,Yu,H.,Mach,K.E.,Wilson,R.J.,Murmann,B.,Liao,J.C.；Gambhir,S.S.,Wang,S.X.Nat.Med.2009,15,1327-1332)；Kelley小組報道了一種采用基于電化學平臺的檢測抗原抗體反應(yīng)的方法，其主要采用了多種貴金屬納米顆粒標記抗體和電化學溶出技術(shù)(參考文獻：Wan,Y.；Zhou,Y.,Poudineh,M.,Safaei,T.S.,Mohamadi,R.M.,Sargent,E.H.,Kelley,S.O.Angew.Chem.Int.Edit.,2014,53,13145-13149)。但是，可以同時多色可視化的檢測出多種抗原抗體反應(yīng)的免疫傳感方法仍然處于探索階段。

三、發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明需要解決的問題是提供一種可視化多色檢測抗原-抗體反應(yīng)試劑盒及使用方法。

本發(fā)明所述試劑盒的由標記了甲基紅修飾石墨烯的CEA抗體，標記了酚酞修飾石墨烯的NSE抗體，標記了百里酚酞修飾石墨烯的Cyfra21-1抗體和包被有CEA、NSE和Cyfra21-1單抗混合物的96孔板，pH值為12.0堿水，PBST緩沖液組成。

本發(fā)明所述試劑盒的使用方法：

(1)制備多抗體標記的96孔板：將多抗原的單抗以一定濃度比例混合后孵育96孔板，洗滌后再用胎牛血清或山羊血清或馬血清進行封閉，封閉時間為30～120分鐘，封閉溫度為25～40℃，處理的目的是為了使標記的抗體能夠與待測樣品充分而穩(wěn)定的反應(yīng)。

(2)抗原抗體反應(yīng)：向步驟1)中加入待測樣品，洗滌后加入修飾有變色小分子的石墨烯標記的抗體，充分反應(yīng)后去除未反應(yīng)的多余石墨烯標記的抗體，所述變色小分子為甲基紅(MR)，或酚酞(PP)或百里酚酞(TP)或溴甲酚紫(BP)或溴甲酚綠(BG)；優(yōu)選為MR、PP和TP，MR、PP和TP與石墨烯分子的質(zhì)量比分別為1：(13.4～53.8)，1：(15.9～95.4)，1：(4.3～43)。所述石墨烯標記的抗體為單抗或多抗。三種變色分子功能化石墨烯的抗體混合物中的濃度配比為1.5:1:0.5。所述抗原-抗體反應(yīng)的孵育時間為30～120分鐘，孵育溫度為25～40℃；

(3)可視化檢測：向步驟2)反應(yīng)體系中加入堿性水，充分反應(yīng)后根據(jù)反應(yīng)體系顏色的變化判斷樣品中是否發(fā)生反應(yīng)，所述堿性水pH值為10.0～13.0，用20mM氫氧化鈉調(diào)配，所述反應(yīng)體系的顏色變化在3～15分鐘內(nèi)出現(xiàn)。