[發(fā)明專利]人類MTHFR和MTRR基因多態(tài)性檢測(cè)引物和試劑盒

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510428708.1
• 申請(qǐng)日: 2015-07-20
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN105002275A
• 公開(kāi)（公告）日: 2015-10-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 周鵬飛;蔡從利;張喆;葉婷;張浩
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 武漢友芝友醫(yī)療科技有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京市百倫律師事務(wù)所 11433
• 代理人: 周紅力

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體的，涉及人類MTHFR和MTRR基因多態(tài)性檢測(cè)引物、探針和試劑盒。

背景技術(shù)

葉酸(Folic?Acid)是指具有相關(guān)生物活性的一類同效水溶性B族維生素，其在機(jī)體內(nèi)的活性形式為5-甲基四氫葉酸，為細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖的必須物質(zhì)，參與體內(nèi)很多重要的代謝反應(yīng)。作為體內(nèi)一碳單位的傳遞體，葉酸參與嘌呤、胸腺嘧啶、核苷酸等多種物質(zhì)的合成和轉(zhuǎn)化，同時(shí)影響磷脂、肌酸、神經(jīng)介質(zhì)的生成，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞與腦細(xì)胞發(fā)育。葉酸缺乏會(huì)導(dǎo)致高同型半胱氨酸血癥，引起機(jī)體出現(xiàn)多系統(tǒng)損傷，是新生兒神經(jīng)管缺陷，癌癥、慢性萎縮性胃炎、結(jié)腸炎、肝細(xì)胞受損、血栓閉塞性心臟病、巨幼紅細(xì)胞性貧血和白細(xì)胞減少癥、抑郁癥、動(dòng)脈粥樣硬化及其他心血管疾病的重要危險(xiǎn)因素之一。

5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)能催化5,10-亞甲基四氫葉酸產(chǎn)生5-甲基四氫葉酸，參與甲基傳遞與核苷酸合成，是葉酸代謝過(guò)程中的關(guān)鍵酶。其基因位點(diǎn)突變對(duì)酶的活性和熱穩(wěn)定性產(chǎn)生影響，從而影響葉酸和甲硫氨酸代謝。該基因最常見(jiàn)的兩個(gè)單核苷酸多態(tài)性677C>T和1298A>C，在中國(guó)發(fā)生率分別為45.2％和18.6％。MTHFR677C>T突變可造成其編碼的氨基酸由丙氨酸變成纈氨酸，引起耐熱性和酶活性下降，雜合MTHFR?677CT酶活性下降30％，純合677TT酶活性下降65％以上，在低葉酸的環(huán)境下，純合677TT可顯著升高血漿同型氨酸濃度，從而引起靜脈栓塞、肺栓塞、動(dòng)脈粥樣硬化、腦卒中等疾病，攜帶MTHFR?677TT基因型的母親在低葉酸環(huán)境情況下生育神經(jīng)管缺陷的病兒的風(fēng)險(xiǎn)也大大增加。MTHFR?A1298C突變引起編碼的氨基酸由谷氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楸彼幔矔?huì)導(dǎo)致酶活性下降，但下降程度比MTHFR?C677T突變輕微，文獻(xiàn)報(bào)道與高同型胱氨酸血癥無(wú)直接關(guān)系，但與MTHFR?C677T突變有協(xié)同效應(yīng)。甲硫氨酸合成酶還原酶(MTRR)主要作用是將失活的甲硫氨酸合成酶還原為活性狀態(tài)，維持甲基傳遞通路繼續(xù)進(jìn)行，使得體內(nèi)的同型半胱氨酸保持在無(wú)毒水平。其報(bào)道最多的單核苷酸多態(tài)性是66A>G，中國(guó)人群發(fā)生率為25.7％，突變導(dǎo)致其酶活與同型半胱氨酸再甲基化速率降低，引起高同型半胱氨酸血癥。MTHFR和MTRR基因多態(tài)性如表1所示。

表1：MTHFR和MTRR基因多態(tài)性

目前針對(duì)基因多態(tài)性的檢測(cè)方法很多，如直接測(cè)序法，焦磷酸測(cè)序法，高分辨率溶解曲線檢測(cè)法(High?Resolution?Melting?Analysis，HRM)，熒光定量PCR法等。其中最常見(jiàn)方法為測(cè)序法，該方法費(fèi)用較低，但操作耗時(shí)長(zhǎng)且靈敏度低；高分辨率溶解曲線法對(duì)設(shè)備要求比較特殊，在臨床推廣存在一定的困難；傳統(tǒng)熒光定量PCR法在臨床上應(yīng)用較為廣泛，但該方法檢測(cè)基因多態(tài)性一般采用Genotyping方法進(jìn)行檢測(cè)，該方法對(duì)樣本數(shù)量以及多態(tài)性分布有一定要求，樣本量少時(shí)不能對(duì)樣本基因多態(tài)性進(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè)。因此，需要建立一種快速有效的檢測(cè)少量樣本的MTHFR和MTRR基因多態(tài)性的方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于，克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供同時(shí)檢測(cè)人類MTHFR和MTRR基因多態(tài)性的特異性引物序列和試劑盒，以此解決現(xiàn)有基因多態(tài)性檢測(cè)技術(shù)中，樣本量少時(shí)基因多態(tài)性檢測(cè)效果不理想的問(wèn)題。

本發(fā)明提供了同時(shí)檢測(cè)人類MTHFR和MTRR基因多態(tài)性的特異性引物序列，所述特異性引物序列的核苷酸序列如SEQ?ID?No.1-9所示。

本發(fā)明還提供了一種用于同時(shí)檢測(cè)人類MTHFR和MTRR基因多態(tài)性的檢測(cè)試劑盒，其中，所述試劑盒中含有本發(fā)明所述的特異性引物序列。

所述檢測(cè)試劑盒中還含有3組特異性探針，所述3組特異性探針的核苷酸序列分別為SEQ?ID?NO:10與SEQ?ID?NO:11，SEQ?ID?NO:12與SEQ?ID?NO:13，SEQ?ID?NO:14與SEQ?ID?NO:15，且所述特異性探針的5’端修飾有FAM或VIC，3’端修飾有NFQ-MGB。