[發(fā)明專利]一種沼澤型水牛SSR引物及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510426680.8
• 申請(qǐng)日: 2015-07-20
• 公開（公告）號(hào): CN104988148B
• 公開（公告）日: 2017-12-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鄧廷賢;梁賢威;龐春英;譚正準(zhǔn);朱鵬;陸杏蓉;段安琴;黃健;李輝;陳明棠
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣西壯族自治區(qū)水牛研究所
• 主分類號(hào): C12N15/11
• 分類號(hào): C12N15/11;C12Q1/68
• 代理公司: 北京海虹嘉誠(chéng)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司11129
• 代理人: 張濤

【技術(shù)領(lǐng)域】

本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及沼澤型水牛SSR引物在檢測(cè)不同水牛品種遺傳多樣性中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】

據(jù)FAO 2013年的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，2011年底我國(guó)水牛存欄量為2338.2萬頭，僅次于印度11291.6萬頭和巴基斯坦3172.6萬頭，位居世界第三，可謂資源豐富。中國(guó)水牛屬于沼澤型類型，具有耐粗飼、役力大、耐濕、耐高溫、抗病力強(qiáng)等生物學(xué)特點(diǎn)，是我國(guó)南方地區(qū)重要的畜種，其資源豐富，奶質(zhì)優(yōu)良，營(yíng)養(yǎng)豐富，具有“奶中之王”之美稱。但我國(guó)水牛產(chǎn)奶量較低，其泌乳性能遠(yuǎn)低于世界著名的三大河流型水牛品種(摩拉、尼里-拉菲和地中海水牛)。為提升本地水牛的泌乳性能，我國(guó)自上世紀(jì)50年代和70年代分別從印度和巴基斯坦引進(jìn)摩拉和尼里-拉菲水牛加以改良，并取得了較大成效。盡管其產(chǎn)奶量得到了較大的提高，但仍存在著明顯的差異。因此，開發(fā)先進(jìn)的分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)應(yīng)用于優(yōu)良的奶水牛品種選育，對(duì)于改善水牛種質(zhì)資源的創(chuàng)新與利用，尤其是有效的提高選種效率具有重要的意義。

分子標(biāo)記是以個(gè)體間遺傳物質(zhì)內(nèi)核苷酸序列變異為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記，是DNA水平遺傳多態(tài)性直接的反映，可廣泛應(yīng)用于遺傳育種、基因組作圖、基因定位、物種親緣關(guān)系鑒別、基因庫構(gòu)建、基因克隆等研究領(lǐng)域。微衛(wèi)星標(biāo)記，又稱簡(jiǎn)單重復(fù)序列(SSR)，均勻分布于真核生物基因組中，由1-6個(gè)核苷酸的串聯(lián)重復(fù)片段構(gòu)成。由于SSR重復(fù)基序和重復(fù)次數(shù)的不同使其在個(gè)體間呈高度變異性，且數(shù)量豐富，被廣泛應(yīng)用與遺傳雜交育種、繪制染色體遺傳圖譜等領(lǐng)域。與其他的分子標(biāo)記(RFLP、VNTR、RAPD、AFLP、SNP等)相比，SSR標(biāo)記具有多態(tài)性信息含量高、共顯性遺傳、技術(shù)簡(jiǎn)單、重復(fù)性好和特異性強(qiáng)等特點(diǎn)。

目前，SSR標(biāo)記可分為基因組SSR(gSSR)和轉(zhuǎn)錄組SSR(EST-SSR)，且后者比前者更具有經(jīng)濟(jì)和效率。由于EST-SSR來源于DNA的轉(zhuǎn)錄區(qū)域，還比前者更具通用性。傳統(tǒng)的SSR標(biāo)記開發(fā)，一般使用文庫篩選、磁珠富集法以及EST數(shù)據(jù)庫挖掘等手段，存在著費(fèi)時(shí)費(fèi)力、開發(fā)成本高等不足。尤其是第三種方法嚴(yán)重依賴于NCBI中EST數(shù)據(jù)庫，對(duì)于尚未公布基因組測(cè)序信息的物種而言，其應(yīng)用是有限的。但隨著第二代測(cè)序技術(shù)的成熟，以及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)信息的與日俱增，使其成為了開發(fā)EST-SSR的重要手段，并具有方便、快捷、準(zhǔn)確且成本低廉等優(yōu)勢(shì)。目前，沼澤型水牛尚無全基因組序列信息，且SSR引物數(shù)量又少。顯然，不依賴于參考基因組的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序可成為大規(guī)模開發(fā)沼澤型水牛SSR引物的重要方法，利用該技術(shù)構(gòu)建沼澤型水牛轉(zhuǎn)錄本，并以轉(zhuǎn)錄本為參考，組建unigene序列，進(jìn)行后續(xù)的SSR挖掘。鑒定出有效的沼澤型水牛SSR標(biāo)記，對(duì)于沼澤型水牛重要經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)基因的定位、克隆及分子標(biāo)記輔助選擇育種等研究具有重要的科學(xué)意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

本發(fā)明提供了一種沼澤型水牛SSR引物及其應(yīng)用，本發(fā)明通過構(gòu)建相應(yīng)的SSR引物，對(duì)水牛個(gè)體的基因組DNA進(jìn)行SSR擴(kuò)增，通過擴(kuò)增產(chǎn)物分析沼澤型水牛的遺傳多樣性，為沼澤型水牛的重要經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)基因的定位、克隆及分子標(biāo)記輔助選擇育種等研究提供新的思路。本發(fā)明所采取技術(shù)方案是：沼澤型水牛SSR引物在檢測(cè)不同水牛品種遺傳多樣性中的應(yīng)用，所述方法包括以下步驟：

1)沼澤型水牛SSR引物的獲得：分別提取沼澤型水牛各組織器官的總RNA，利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得沼澤型水牛轉(zhuǎn)錄組的Raw Reads，構(gòu)建沼澤型水牛Unigene序列，對(duì)Unigene進(jìn)行SSR位點(diǎn)的檢索，再對(duì)含有SSR位點(diǎn)信息的Unigene序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，獲得一系列沼澤型水牛SSR引物；

2)實(shí)驗(yàn)材料：隨機(jī)選取7個(gè)水牛品種35頭個(gè)體作為模板，即摩拉水牛、尼里-拉菲水牛、西林水牛、富鐘水牛、貴州水牛、德昌水牛和德宏水牛，用于檢測(cè)沼澤型水牛SSR引物在不同水牛品種遺傳多樣性分析中的有效性；

3)血液基因組DNA提?。横槍?duì)每一頭水牛個(gè)體，頸靜脈取血5mL，采用動(dòng)物血液基因組DNA試劑盒(天根，北京)制備每一頭水牛個(gè)體的基因組DNA。利用Nanodrop2000和1.5％的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行基因組DNA樣本質(zhì)控；