[發明專利]一種細胞內溶素和編碼此細胞內溶素的多核苷酸

在審

• 申請號: 201510425902.4
• 申請日: 2015-07-20
• 公開（公告）號: CN105062992A
• 公開（公告）日: 2015-11-18
• 發明（設計）人: 魏云林;趙曉曼;王楠;季秀玲;林連兵;張琦
• 申請（專利權）人: 昆明理工大學
• 主分類號: C12N9/36
• 分類號: C12N9/36;C12N15/56;C12N15/63
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明公開了一種細胞內溶素及編碼該蛋白的基因，該具有胞壁質水解活性的細胞內溶素編碼基因序列如SEQ ID NO：1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；通過構建重組載體并在大腸桿菌中表達表達產物具有胞壁質水解功能，本發明的細胞內溶素可作為對抗蠟樣芽孢桿菌致病性的良好材料。

技術領域

本發明涉及生物化學及分子生物學研究，用于治療或預防革蘭氏陽性細菌感染、作為診斷手段等疾病治療領域，及食品加工處理過程，醫療設備表面的細菌污染等，具體涉及一種革蘭氏陽性菌細胞內溶素蛋白，編碼該蛋白的基因、含有其編碼基因的重組載體、基因工程菌及其應用。

背景技術

蠟樣芽孢桿菌是需氧型、β溶血性革蘭氏陽性菌，能形成芽孢抵抗強酸、強堿、高氧、低氧等極端環境。其分布較為廣泛，土壤、空氣、腸道和許多事物上都能分離得到。一部分屬于益生菌，具有一定的經濟價值，可產生抗菌物質以改善生態環境，還可用于明膠液化，牛奶解凍，水解淀粉等。少數屬于機會致病菌，可引起食物中毒，眼內炎等疾病。芽孢桿菌噬菌體是以蠟樣芽孢桿菌為宿主的病毒，在生物發酵、農業生產和生態循環上是一把雙刃劍，既有潛在的應用價值，少部分又有摧毀性的損害。

細胞內溶素是噬菌體在侵染細菌時裂解期合成的，作用于細胞壁肽聚糖并能破壞肽聚糖層，具有胞壁質水解活性的蛋白。革蘭氏陽性菌噬菌體的細胞內溶素蛋白通常由兩個功能結構域構成：氮末端催化結構域和碳末端細胞壁結合結構域。根據酶的作用位點專一性，可將細胞內溶素蛋白劃分為四類：（1）氮-乙酰胞壁質酶（溶菌酶或胞壁質酶），作用于氮-乙酰胞壁酸和氮-乙酰-D-葡糖胺之間的β-1,4-糖苷鍵；（2）內切-β-氮-乙酰氨基葡萄糖苷酶（氨基葡糖苷酶），切割肽聚糖中的糖基；（3）氮-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶（NAM-酰胺酶），切割氮-乙酰胞壁酸和L-丙氨酸之間的酰胺鍵；（4）內肽酶，切割肽鏈之間的連接。細胞內溶素可作為生物抗菌劑，具有很低的細菌抗性發生率；菌種特異性的裂解活性，不會影響宿主周圍其它菌種；同時有很高的酶活性，使得細胞可在數分鐘甚至在數秒內被裂解。

荷蘭Micreos公司改造的細胞內溶素可有效的殺滅耐藥性葡萄球菌，Pritchard DG，CeliaL K，Shukla S K，等的實驗證明，噬菌體細胞內溶素能快速溶解多種奶牛乳房炎環境致病菌，在未來幾年細胞內溶素可能作為主要成分運用到抗菌噴霧劑，漱口劑，栓劑及滴眼液中。蠟樣芽孢桿菌噬菌體細胞內溶素也可能有相似的運用前景，可用于防治蠟樣芽孢桿菌引起的感性染性眼內炎和食物中毒；也可用作為化妝物質或消毒劑，用來處理或防止食品、食品加工設備，餐具等表面的細菌污染；此外，還可能作為刺參培育中蠟樣芽孢桿菌引起的腐皮綜合征專一性抑菌劑。

發明內容

本發明的目的旨在提供一種從蠟樣芽孢桿菌噬菌體VMY22中克隆得到的細胞內溶素（Endolysin）基因，該基因核苷酸序列或核苷酸序列的片段如SEQ ID NO：1所示，或與SEQID NO：1互補的核苷酸序列，該基因序列長度為738bp（堿基）。

本發明的核苷酸序列是DNA形式的，包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA，可以是單鏈的或是雙鏈的。由于核苷酸序列的特殊性，任何與SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列具有80%以上同源性且具有相同功能的多核苷酸變體，均在本發明的保護范圍之內。所述多核苷酸變體是指一種具有一個或多個核苷酸改變的多核苷酸序列，可以使用本領域所熟知的取代、缺失或插入變異來獲得。

本發明中的細胞內溶素基因編碼的氨基酸序列是具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸殘基序列的多肽或蛋白質。由于氨基酸序列的特殊性，只要是含有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽片段或其變體，如其保守性變體、生物活性片段或衍生物與SEQ ID NO：2所示的氨基酸殘基序列具有90%以上同源性且具有相同活性的蛋白質，均在本發明的保護范圍之內。這些方法包括氨基酸序列中氨基酸殘基的缺失、插入、化學修飾或替換，所述蛋白可以是重組蛋白、天然蛋白或合成蛋白。