[發(fā)明專利]一種薄殼山核桃細(xì)胞胚胎組織培養(yǎng)的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510420757.0
• 申請日: 2015-07-16
• 公開（公告）號(hào): CN104957040A
• 公開（公告）日: 2015-10-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 湯榕;湯槿;侯超
• 申請（專利權(quán)）人: 句容市容北茶文化有限公司
• 主分類號(hào): A01H4/00
• 分類號(hào): A01H4/00
• 代理公司: 南京蘇高專利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙) 32204
• 代理人: 許丹丹

1.一種薄殼山核桃細(xì)胞胚胎的組織培養(yǎng)方法，其特征在于：包括以下步驟：

（1）選材：選取4年生薄殼山核桃優(yōu)選單株的當(dāng)年生萌條，將其剪成5~6cm的帶芽小段；

（2）對(duì)帶芽小段外植體進(jìn)行消毒處理；

（3）芽誘導(dǎo)培養(yǎng)：在無菌條件下，將步驟（2）中的外植體用剪刀去除莖段頭尾氧化變黑部分，直接種于芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)11~20d，分化長成無菌芽苗；所述芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配方為：WPM基本培養(yǎng)基，附加0.05~0.08mg.L^-16-BA、??0.05~0.06mg.L^-1NAA、25~40g.L^-1蔗糖、18~21?g.L^-1蜂膠乳油、11~13?g.L^-1檸檬酸、6.5~7.0?g.L^-1卡拉膠，調(diào)pH值為5.2~5.4；

（4）體胚誘導(dǎo)：將步驟（3）中長成的無菌苗嫩葉接種到體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)15~30d；體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為：MS基本培養(yǎng)基，附加0.16~0.20?mg.?L^-16-BA、0.2~0.3mg.?L-1NAA、0.08~0.12?mg.?L-12,4-D、0.05~0.06mg.L-1??玉米素，25~40g.L-1蔗糖、9.5~11.0g.L-1酵母膏、6.5~7.0g.L-1卡拉膠，調(diào)pH值為5.7~5.8；

（5）體胚增殖培養(yǎng)：將步驟（4）中誘導(dǎo)產(chǎn)生的體胚，進(jìn)行增殖培養(yǎng)，20~25d后，體胚迅速增殖呈黃色透明顆粒狀；體胚增殖培養(yǎng)基配方為：MS基本培養(yǎng)基，附加1.8~2.0?mg.?L-16-BA、0.01~0.03?mg.?L-1NAA、25~40g.L-1蔗糖、6.5~7.0?g.L-1卡拉膠、0.05~0.08mg.?L蕓苔素內(nèi)酯、0.03~0.06mg.L長春堿，調(diào)pH值為5.7~5.8；

（6）成熟培養(yǎng)：將步驟（5）中增殖獲得的體胚，接種于含有成熟培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)32~51d；體胚成熟培養(yǎng)基配方為：MS基本培養(yǎng)基，附加40~60g.L^-1蔗糖、6.5~7.0?g.L^-1卡拉膠，調(diào)pH值為5.7~5.8；

（7）體胚的萌發(fā)：將步驟（6）中獲得的成熟體胚接種于萌發(fā)培養(yǎng)基中培養(yǎng)42~58d進(jìn)行植株再生；所述體胚萌發(fā)培養(yǎng)基配方為：MS基本培養(yǎng)基，附加8~12?g.?L^-1山梨醇、20~30g.L^-1蔗糖、6.5~7.0?g.L^-1卡拉膠，調(diào)pH值為5.7~5.8?；

所述的MS基本培養(yǎng)基的具體配方如下：

硝酸鉀KNO3????　　　1900?mg/L

硝酸銨NH4NO3??????　1650?mg/L

磷酸二氫鉀KH2PO4??????　170?mg/L

硫酸鎂MgSO4.7H2O?????370?mg/L

氯化鈣CaCl2.2H2O?　　440?mg/L

碘化鉀KI???　　　　　0.83?mg/L

硼酸H3BO3?????　　　　6.2?mg/L

硫酸錳?MnSO4.4H2O???22.3?mg/L

硫酸鋅　ZnSO4.7?H2O????????8.6?mg/L

鉬酸鈉?Na2MoO4.2?H2O?????0.25?mg/L

硫酸銅　CuSO4.5?　?????0.025?mg/L

氯化鈷?CoCl2.6?H2O????　　　0.025?mg/L

乙二胺四乙酸二鈉?Na2.EDTA???37.3?mg/L

硫酸亞鐵FeSO24.7H2O???????27.8?mg/L

肌醇?????　　　　　　　　　100?mg/L

甘氨酸????????　　　　　　　2?mg/L

鹽酸硫胺素VB1?????　　　　0.1?mg/L

鹽酸吡哆醇　VB6?　　　???0.5?mg/L

煙酸VPP?????　　　　　　　0.5?mg/L

羧甲基纖維素鈉???????????0.9?mg/L。