[發(fā)明專利]一種用于生物樣本的核酸提取方法及試劑

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510410272.3
• 申請日: 2015-07-13
• 公開（公告）號: CN105176969B
• 公開（公告）日: 2018-11-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 范倻;王岱桑;金成芳;朱勤鋒;孫剛;胡林;尤其敏
• 申請（專利權(quán)）人: 杭州優(yōu)思達(dá)生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 北京元中知識產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11223
• 代理人: 王明霞

本發(fā)明涉及核酸提取領(lǐng)域，具體講，涉及一種用于生物樣本的核酸提取方法及試劑；具體方法為：將生物樣本中先加入氫氧化鈉溶液，然后加入裂解液進(jìn)行裂解，得到裂解反應(yīng)液；所述的裂解液中含有胍鹽、乙二胺四乙酸二鈉、表面活性劑和緩沖劑；再在裂解反應(yīng)液中加入乙醇溶液，最后采用帶有硅膠膜的無儀器核酸提取裝置或離心柱實(shí)現(xiàn)核酸的吸附、清洗和洗脫。本發(fā)明采用了先加氫氧化鈉預(yù)處理、再加入裂解劑進(jìn)行裂解的方式，可以更好地溶解樣本中的蛋白質(zhì)，并促進(jìn)核酸與吸附膜的結(jié)合。本發(fā)明還優(yōu)化了裂解液組分，顯著增強(qiáng)了核酸分子在高鹽高pH條件下與硅膠膜的結(jié)合能力，確保了良好的核酸提取效率。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及核酸提取領(lǐng)域，具體講，涉及一種用于生物樣本的核酸提取方法及試劑。

背景技術(shù)

核酸提取是許多臨床檢驗(yàn)工作的首要環(huán)節(jié)。該環(huán)節(jié)下獲得的核酸模板，其濃度和純度直接影響了后續(xù)檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。離心柱法是臨床檢驗(yàn)中常見的核酸提取方法。該方法利用核酸分子在高鹽低pH環(huán)境下與硅膠膜結(jié)合，低鹽高pH環(huán)境下與硅膠模解離的特性，可從痰液、血液、尿液等多種類型的樣本中特異性地富集和純化核酸模板。配合高速離心機(jī)或自動(dòng)化的核酸提取儀，離心柱法具有通量大、速度快、提取效率高、模板純度好等優(yōu)點(diǎn)，能滿足大多數(shù)臨床實(shí)驗(yàn)室的檢驗(yàn)要求。除離心柱法外，市場上還出現(xiàn)了不依賴離心機(jī)的無儀器核酸提取裝置。這種裝置以注射器的手工推吸作用替代了離心機(jī)的離心沉降作用，使用時(shí)無需電源、且操作簡便、通量靈活，更加符合基層醫(yī)療單位開展分子診斷工作的實(shí)際需求。

市場上現(xiàn)有的細(xì)菌或細(xì)胞基因組核酸提取產(chǎn)品，大多采用離心的方式，首先分離臨床樣本的沉淀物與上清液，并丟棄上清液，僅將沉淀物用于后續(xù)的核酸提取，以減少抑制物殘留對后續(xù)檢測結(jié)果的影響。這種“丟棄上清液、保留沉淀物”的核酸純化方式僅適用于新鮮未降解的臨床樣本，而那些經(jīng)過高溫滅活或冷凍儲存的臨床樣本，往往伴有細(xì)菌或細(xì)胞裂解的情況，其結(jié)果導(dǎo)致大量的基因組核酸游離在上清液中。丟棄上清液無疑將損失大量的核酸模板，降低后續(xù)檢測的靈敏度，因此需要一種既能保留上清液，又能減小上清液中抑制物殘留的核酸提取方法。

此外，如何充分裂解樣本也是核酸提取的技術(shù)難點(diǎn)之一，這對無儀器核酸提取裝置尤為重要。由于手工操作的力量遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于高速離心機(jī)，無儀器核酸提取裝置往往采用孔徑更大的硅膠膜過濾樣本，以減小濾膜堵塞的風(fēng)險(xiǎn)。但僅僅使用大孔徑的濾膜和常規(guī)的核酸提取試劑還無法使該裝置適用于蛋白質(zhì)含量較高的臨床樣本，如全血、血漿等，因此需要一種溶解效果更好、裂解效率更高的核酸提取試劑。

針對上述兩個(gè)問題，現(xiàn)已公開了一些改良的核酸提取技術(shù)和試劑：

專利ZL200910032536.0公開了一種硅膠膜型DNA快速提取及保存DNA的方法，該專利采用高鹽低pH條件吸附DNA，通過一種含有細(xì)胞裂解劑、核酸酶抑制劑的溶液處理硅膠膜后，無需預(yù)先提取DNA的過程，直接將細(xì)胞裂解并將DNA吸附在硅膠膜上，同時(shí)由于核酸酶抑制劑的存在，該吸附DNA的硅膠膜可長期保存，避免DNA的降解。該專利中公開的方法雖然可以用于DNA的保存，但其裂解液為低pH條件，溶解蛋白質(zhì)的能力較差，容易造成無儀器核酸提取裝置的堵塞，因而僅適用于離心柱式的核酸提取方法。

專利申請201010621890.X公開了一種用于生物樣品中核酸提取純化的細(xì)胞裂解試劑，該試劑溶液呈堿性并含有胍鹽、銨根離子及表面活性劑成分，在堿性液相環(huán)境下能更充分裂解生物樣品中的細(xì)胞，并能促進(jìn)釋放到細(xì)胞外的核酸(DNA/RNA)與固相材料的結(jié)合吸附，最后通過洗脫步驟將核酸從固相材料上分離下來。該專利申請中雖然公開了pH 8～13的堿性裂解條件，但通過添加銨根離子僅能使裂解液的pH達(dá)到9左右。而通入氨氣雖然能達(dá)到更高的堿性條件，但氨氣易揮發(fā)，不便于長期穩(wěn)定保存。