[發(fā)明專利]一種用于特異性檢測(cè)腸桿菌科細(xì)菌的引物、探針及其應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510368799.4
• 申請(qǐng)日: 2015-06-29
• 公開（公告）號(hào): CN105002270A
• 公開（公告）日: 2015-10-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張貴海;崔溢;王亞卿
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 張貴海
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12Q1/10;C12N15/11
• 代理公司: 北京名華博信知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11453
• 代理人: 苗源;李冬梅

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于微生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種特異性檢測(cè)腸桿菌科細(xì)菌的引物、探針及其應(yīng)用，并進(jìn)一步公開了一種特異性檢測(cè)腸桿菌科細(xì)菌的方法。

背景技術(shù)

腸桿菌科細(xì)菌隸屬于細(xì)菌界，腸桿菌科包括無(wú)芽孢、周身鞭毛或無(wú)鞭毛的革蘭氏染色陰性直桿菌，具有分布廣的特點(diǎn)，其寄主范圍大，人、動(dòng)物、植物都有寄生或共生、附生、腐生，也可在土壤或水中生存，與人類關(guān)系密切。腸桿菌科細(xì)菌易于培養(yǎng)，繁殖快(在適宜條件下每20～30分鐘可增殖一代)。

腸桿菌科細(xì)菌具有化能有機(jī)營(yíng)養(yǎng)，兼營(yíng)呼吸代謝和發(fā)酵代謝；可通過氧化多種簡(jiǎn)單有機(jī)化合物或發(fā)酵糖、有機(jī)酸或多元醇來(lái)獲取能量；大部分能在含有一種碳源的無(wú)機(jī)氮培養(yǎng)基上生長(zhǎng)；有些種生長(zhǎng)時(shí)需要某種氨基酸或水溶性維生素；除個(gè)別血清型外，接觸酶均為陽(yáng)性，氧化酶陰性；除歐文氏菌屬中的少數(shù)種外，均還原硝酸鹽為亞硝酸鹽；DNA(脫氧核糖核酸)中的G+C(鳥嘌呤和胞嘧啶)克分子含量為39～59％。

而阪崎腸桿菌，屬于腸桿菌科，是寄生在人和動(dòng)物腸道內(nèi)的革蘭氏陰性菌，無(wú)芽孢，周生鞭毛，能運(yùn)動(dòng)，其包括埃希氏菌屬、沙門氏菌屬、志賀氏菌屬、克雷伯氏菌屬、沙雷氏菌屬、變形桿菌屬、耶爾森氏菌屬等屬的菌體。阪崎腸桿菌可導(dǎo)致嬰兒及早產(chǎn)兒腦膜炎、敗血癥和壞死性結(jié)腸炎，死亡率高達(dá)50％，已引起世界多國(guó)相關(guān)部門的重視。國(guó)家食源性疾病監(jiān)測(cè)網(wǎng)自2007年起把阪崎腸桿菌列為嬰兒配方食品重點(diǎn)監(jiān)測(cè)病原菌。

目前大多數(shù)中國(guó)企業(yè)采用培養(yǎng)基篩選法檢測(cè)嬰兒配方食品中的阪崎腸桿菌，具體操作參照國(guó)標(biāo)478940-2010，操作步驟如下：

(1)前增菌和增菌

取檢樣100g(mL)加入已預(yù)熱至44℃裝有900mL緩沖蛋白胨水的錐形瓶中，用手緩緩地?fù)u動(dòng)至充分溶解，36℃±1℃培養(yǎng)18h±2h。移取1mL轉(zhuǎn)種于10mL?mLST-Vm肉湯，44℃±0.5℃培養(yǎng)24h±2h。

(2)分離

2.1輕輕混勻mLST-Vm肉湯培養(yǎng)物，各取增菌培養(yǎng)物1環(huán)，分別劃線接種于兩個(gè)阪崎腸桿菌顯色培養(yǎng)基平板，36℃±1℃培養(yǎng)24h±2h。

2.2挑取1個(gè)～5個(gè)可疑菌落，劃線接種于胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)平板。25℃±1℃培養(yǎng)48h±4h。

(3)鑒定

自TSA平板上直接挑取黃色可疑菌落，進(jìn)行生化鑒定。可選擇生化鑒定試劑盒或全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)。

上述培養(yǎng)基篩選法的缺點(diǎn)如下：

1、總的檢測(cè)時(shí)間需5天左右，且需要接種大量不同的培養(yǎng)皿，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。

2、需要大量培養(yǎng)基原材料，耗材等。

3、需要大量的空間放置這些培養(yǎng)皿以及需要大量的人力清洗培養(yǎng)皿。

除培養(yǎng)基篩選法以外還有熒光PCR方法的檢測(cè)技術(shù)(中華人民共和國(guó)出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T1632.3-2005)。PCR全稱是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。使用兩段(20-24個(gè)核苷酸)寡核苷酸作為反應(yīng)的引物，這兩段寡核苷酸引物的序列不發(fā)生互補(bǔ)作用。但它們可以和成為模板的待測(cè)DNA兩條鏈上的位點(diǎn)分別發(fā)生互補(bǔ)。反應(yīng)液由包括含有鎂離子的反應(yīng)緩沖液，DNA聚合酶，4種單核苷酸(dNTP)，模板DNA以及引物組成。通過溫度的變化(變性，退火，延伸)合成兩個(gè)互補(bǔ)位點(diǎn)之間的DNA片段。這樣的反應(yīng)反復(fù)進(jìn)行，使DNA片段得以擴(kuò)增。經(jīng)30左右個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增倍數(shù)達(dá)106。

而熒光PCR是在普通PCR基礎(chǔ)上加入一條特異的寡核苷酸熒光探針，該探針5’端標(biāo)記了FAM熒光素，3’端標(biāo)記了TAMRA熒光素，此時(shí)FAM的熒光被TAMRA猝滅，儀器檢測(cè)不到熒光。PCR延伸階段，DNA聚合酶發(fā)揮其5’-3’外切核酸酶功能，將探針切割，與此同時(shí)標(biāo)記在探針上的FAM游離出來(lái)，其所發(fā)出的熒光不再被TAMRA所猝滅而被儀器檢測(cè)到。PCR過程中，每對(duì)目的片段進(jìn)行一次有效的擴(kuò)增，同時(shí)對(duì)探針進(jìn)行了一次切割以及對(duì)FAM進(jìn)行了一次檢測(cè)。儀器檢測(cè)到FAM的增量，可以間接的反映目的片段的擴(kuò)增量。具體操作步驟如下：

(1)、取1mL增菌后的樣品加到1.5mL無(wú)菌離心管中；

(2)、8000r/min離心5min，盡量去除上清液；

(3)、加50μLDNA提取液，充分混勻；

(4)、沸水浴5min；

(5)、12000r/min離心5min。上清液即可作為模板DNA進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增；