[發明專利]一種用于特異性檢測腸桿菌科細菌的引物、探針及其應用

在審

• 申請號: 201510368799.4
• 申請日: 2015-06-29
• 公開（公告）號: CN105002270A
• 公開（公告）日: 2015-10-28
• 發明（設計）人: 張貴海;崔溢;王亞卿
• 申請（專利權）人: 張貴海
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/10;C12N15/11
• 代理公司: 北京名華博信知識產權代理有限公司 11453
• 代理人: 苗源;李冬梅

1.一種特異性檢測腸桿菌科細菌的引物，其特征在于，所述引物的序列結構如下：

腸桿菌科-F：5′-CTG?AAA?GCA?TCT?AAG?CAC?GAA?ACT?TG-3′；

腸桿菌科-R：5′-GTC?GTC?TTC?AAC?GTT?CCT?TCA?GG-3′；

內部陽性對照-F：5′-TGT?GAA?ATA?CCG?CAC?AGA?TG-3′；

內部陽性對照(IAC)-R：5′-AGC?TGG?CGT?AAT?AGC?GAA?G-3′。

2.一種用于特異性檢測阪崎腸桿菌的探針，其特征在于，所述探針的序列結構如下：

腸桿菌科細菌探針：

5′-HEX-AGAGTAGTAGTTGTAGAGGCCGTGCTTCCGAAAG-BHQ-1-3′；內部陽性對照探針：

5′-ROX-TAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCC-BHQ-2-3′。

3.一種用于特異性檢測腸桿菌科細菌的試劑盒，其特征在于：包括權利要求11所述的引物及權利要求12所述的探針，以及光敏感性物質。

4.根據權利要求3所述的用于特異性檢測腸桿菌科細菌的試劑盒，其特征在于：所述光敏感性物質包括可與DNA的堿基形成共價鍵的溴化乙錠單疊氮溴(EMA)，其濃度為125μg/mL。

5.根據權利要求3或4所述的用于特異性檢測腸桿菌科細菌的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括：

內部陽性對照物，所述內部陽性對照物包括pUC19質粒DNA；

DNA聚合酶和尿嘧啶-DNA糖基化酶的混合物；

腸桿菌科細菌的DNA為陽性對照、PCR級水為陰性對照；

緩沖蛋白胨水和DNA提取液；

并選擇性的添加可視化的黃色染料。

6.一種特異性檢測腸桿菌科細菌的方法，其特征在于，采用如權利要求3-5中任意一項所述的試劑盒，該檢測方法包括以下的步驟：

(1)DNA的提?。?/p>

取待檢樣品進行增殖培養、富集，向100μl富集液中加入300μl溴化乙錠單疊氮溴，然后室溫暗室培養5min，之后在500W光下曝光5min，離心、除去上清液，再加入DNA提取液，充分混勻、培養、離心，取上清液作為模板DNA；

(2)PCR反應體系：

25μL的反應體系包括18μL所述引物和探針；1μL的所述DNA聚合酶和尿嘧啶-DNA糖基化酶的混合物；1μL內部陽性對照物；5μL模板DNA或陽性對照物或陰性對照物；

(3)PCR反應程序：

在37℃下4min，95℃預變性5min；95℃變性10s，65℃退火延伸70s，40個循環，同時收集FAM，HEX和ROX熒光信號；

(4)結合擴增曲線圖判定實驗結果。

7.一種用于特異性檢測腸桿菌科及阪崎腸桿菌的試劑盒，其特征在于：包括：

阪崎腸桿菌-F：5′-AGG?GGA?TAT?TGT?CCC?CTG?AAA?CAG-3′；

阪崎腸桿菌-R：5′-AAA?CGA?GAA?TAA?GCC?GCG?CAT?T-3′；

腸桿菌科-F：5′-CTG?AAA?GCA?TCT?AAG?CAC?GAA?ACT?TG-3′；

腸桿菌科-R：5′-GTC?GTC?TTC?AAC?GTT?CCT?TCA?GG-3′；

內部陽性對照-F：5′-TGT?GAA?ATA?CCG?CAC?AGA?TG-3′；

內部陽性對照(IAC)-R：5′-AGC?TGG?CGT?AAT?AGC?GAA?G-3′；

阪崎腸桿菌探針：

5′-HEX-AGAGTAGTAGTTGTAGAGGCCGTGCTTCCGAAAG-BHQ-1-3′；

腸桿菌科探針：

5′-HEX-AGAGTAGTAGTTGTAGAGGCCGTGCTTCCGAAAG-BHQ-1-3′；

內部陽性對照探針：

5′-ROX-TAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCC-BHQ-2-3′；

以及光敏感性物質。