[發明專利]基于LAMP技術檢測罌粟殼成分的引物、試劑盒及方法

有效

• 申請號: 201510362886.9
• 申請日: 2015-06-25
• 公開（公告）號: CN105087556B
• 公開（公告）日: 2018-02-16
• 發明（設計）人: 陳定虎;陳祖華;劉恭源;熊仁廣;王振華;周敏;劉曉媚;吳穎兒;張靜;馮雪雅
• 申請（專利權）人: 陳定虎
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/6895;C12Q1/6844
• 代理公司: 中山市興華粵專利代理有限公司44345
• 代理人: 吳劍鋒

1.一種基于LAMP技術檢測罌粟殼成分用的試劑盒，其特征在于包括以下組分：

a、LAMP反應液緩沖液0.6mL；

b、引物250μL；

c、熒光染料50μL；

d、酶溶液50μL；

e、陽性對照50μL；

f、去離子水1000μL；

產品規格：45次；

操作方法：

1).試劑的配制：

a.取-20℃下保存的各種試劑在室溫下解凍，解凍后立即置于冰上保存；

b.在冰上配制預混液：取檢測所需的反應量，按照下表比例制備一個反應的量，將下表中的組分分別分裝在另外準備的預混溶液配制用的滅菌管中：

c.分裝后輕彈擊試管使其混勻，瞬時離心數秒使溶液集中在試管底部；

2).加樣：往分裝好的試管中分別加入制備好的待檢測樣品的DNA 5μL即10ng，使總量達到25μL，陰性對照反應使用去離子水5μL作為樣品，陽性對照反應使用帶有罌粟DNA的陽性對照，然后蓋上試管蓋輕擊混合，瞬時離心使反應溶液集中在試管底部；

3).擴增：將試管放置在恒溫器中，在63℃下保持恒溫1小時，然后在80℃下保持恒溫5分鐘使酶滅活以終止反應；

4).檢測：使用紫外線照射裝置，波長240-260nm，350-370nm，從試管底部向上進行照射，佩戴紫外防護眼鏡從試管側面進行觀察，如果與陽性對照一樣發出綠光，則判定為陽性，如果與陰性對照一樣沒有發出熒光，而判定為陰性；

注意事項及保存條件：

所有試劑于-20℃保存，避免多次反復凍融及造成污染，配制好的預混溶液要立即使用；

其中所述引物包括：

正向外引物F3：5'‐CTGCGAAAACTATTATCGATGA‐3’；

反向外引物B3：5'‐CACGTTTAGGGGTACTGAT‐3’；

正向內引物FIP：

5'‐GCCATGGATTCACCCCAACT‐TTCCCTGAACTGGGGTTAG‐3’；

其中所述正向內引物FIP包含F1c和F2序列：

F1c：GCCATGGATTCACCCCAACT；

F2：TTCCCTGAACTGGGGTTAG

反向內引物BIP：

5'‐TACCATCTCTGAACTAAACAACAGG‐TCAACTTTAGTCTTAAAAGCTCT‐3’

所述反向內引物BIP包括含B1c和B2序列：

B1c：TACCATCTCTGAACTAAACAACAGG；

B2：TCAACTTTAGTCTTAAAAGCTCT。