[發(fā)明專利]一種切梢小蠹伴生菌野外分離法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510361389.7
• 申請日: 2015-06-28
• 公開（公告）號: CN104911112A
• 公開（公告）日: 2015-09-16
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 葉輝;潘悅;周旭東;呂軍;陳鵬;陸紅葉;朱玲玲
• 申請（專利權(quán)）人: 云南大學(xué)
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14
• 代理公司: 昆明大百科專利事務(wù)所 53106
• 代理人: 李云

技術(shù)領(lǐng)域

?本發(fā)明涉及切梢小蠹伴生菌分離方法技術(shù)領(lǐng)域，屬于森林病蟲害防治領(lǐng)域。

背景技術(shù)

切梢小蠹是以松樹為主的針葉樹鉆蛀性害蟲，迄今已經(jīng)描述的有7種，主要有縱坑切梢小蠹（Tomicus?piniperda）、橫坑切梢小蠹?(T.?minor)、云南切梢小蠹(?T.?yunnanensis)、松芽切梢小蠹?(T.?brevipilosus)?和華山松切梢小蠹?(T.?armandii)等。其中，橫坑切梢小蠹和華山松切梢小蠹是目前我國主要松樹害蟲，特別是上世紀(jì)80?年代以來，這些切梢小蠹在云南松林區(qū)暴發(fā)成災(zāi)，導(dǎo)致近百萬畝云南松林完全毀滅。進(jìn)入本世紀(jì)以來，切梢小蠹災(zāi)害仍持續(xù)保持高位，在以云南為主的整個西南云南松林區(qū)，每年危害面積仍在150萬畝以上，給當(dāng)?shù)亓謽I(yè)生產(chǎn)造成嚴(yán)重?fù)p失。

切梢小蠹在蛀害松樹過程中常常將病原真菌帶入樹木韌皮部，該病原菌因與切梢小蠹具有較為緊密的生態(tài)學(xué)聯(lián)系，且往往由切梢小蠹所攜帶，故又稱之為切梢小蠹伴生菌。其菌絲體在樹木韌皮部及木質(zhì)部內(nèi)生長，并將受害部位韌皮組織和木質(zhì)部染成藍(lán)色。研究表明，切梢小蠹伴生菌對于削弱寄主樹木抗性、協(xié)助切梢小蠹侵害具有積極協(xié)同和促進(jìn)作用。因此，切梢小蠹伴生菌研究，對探索切梢小蠹與其伴生菌的生態(tài)學(xué)關(guān)系，全面闡釋切梢小蠹危害成災(zāi)機制均具有重要意義。

切梢小蠹在寄主樹木內(nèi)的蛀食活動將在樹木韌皮組織內(nèi)留下蛀食坑道，由切梢小蠹雌蟲蛀食所留下坑道稱為母坑道，由切梢小蠹幼蟲蛀食所留下的坑道稱為子坑道。由于切梢小蠹伴生菌是由切梢小蠹所攜帶，伴隨其蛀食過程而傳播，因而切梢小蠹伴生菌主要從切梢小蠹母坑道入侵，首先在切梢小蠹母坑道發(fā)育形成。為此，切梢小蠹母坑道是確定并分離切梢小蠹伴生菌的理想場所，同時，切梢小蠹伴生菌也會在子坑道中出現(xiàn)，某些情況下母坑道中的伴生菌受其它類型真菌影響不易分離時可從子坑道入手，因此查找伴生菌時需對切梢小蠹各蛀食坑道逐一檢查。

切梢小蠹伴生菌分離是切梢小蠹伴生菌研究的基礎(chǔ)。在過去，分離切梢小蠹伴生菌的方法大體上是到切梢小蠹發(fā)生林區(qū)，砍伐被切梢小蠹為害的樹木，將受害樹木木段或受害韌皮組織、藍(lán)變組織等帶回實驗室，在實驗室內(nèi)進(jìn)行伴生菌分離。該分離方法存在木段運輸工作量大、采樣組織保存時間不長、分離時間周期長、污染率高、分離效率低等不足。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是解決現(xiàn)有技術(shù)存在采樣和分離工作量大、污染率高和分離周期長等問題，提出一種可有效降低污染率和節(jié)省分離時間、顯著提高小蠹蟲伴生菌分離效率的切梢小蠹伴生菌野外分離法。

?本發(fā)明的目的通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)：

一種切梢小蠹伴生菌野外分離法，該方法為先確定林內(nèi)受害松樹上切梢小蠹侵入孔，以侵入孔為起點沿切梢小蠹蟲母坑道方向，剝?nèi)デ猩倚◇枷x母坑道表面樹皮，露出切梢小蠹蛀食母坑道韌皮組織，若母坑道兩側(cè)已形成子坑道，則將其一并露出，檢查確證切梢小蠹各坑道內(nèi)是否存在切梢小蠹伴生菌孢子、菌絲、子囊殼以及藍(lán)變韌皮組織，根據(jù)切梢小蠹伴生菌生長發(fā)育進(jìn)度及藍(lán)變韌皮組織情況，采取對應(yīng)的切梢小蠹伴生菌分離措施，具體的對應(yīng)措施包括有：

1）如果發(fā)現(xiàn)切梢小蠹蛀食坑道內(nèi)黑色成熟子囊殼頂端著生白色或透明、半透明伴生菌孢子，即用滅菌細(xì)竹簽挑取單個孢子在2%MEA上培養(yǎng)；

2）如果坑道中僅發(fā)現(xiàn)深灰色菌絲或不成熟子囊殼，則切割下小薄段帶有坑道的韌皮組織于加保濕棉層的自封袋中培養(yǎng)3~7天，待坑道內(nèi)長出孢子再挑取到2%?MEA培養(yǎng)基上；

3）如果只發(fā)現(xiàn)藍(lán)變的韌皮組織，則用75%酒精在韌皮部進(jìn)行表面消毒后剝離外層藍(lán)變組織，取小薄片內(nèi)部藍(lán)變組織插入2%?MEA培養(yǎng)基培養(yǎng)。

本發(fā)明具有以下優(yōu)點：

1）直接在林中受害樹木上挑取切梢小蠹坑道內(nèi)著生在韌皮組織表面的伴生菌孢子，簡化了過去切梢小蠹伴生菌采集和分離的繁瑣步驟，簡便易行；

2）當(dāng)切梢小蠹坑道中只有菌絲或不成熟子囊殼時，將該坑道韌皮組織切成小塊，放入加有保濕棉層的塑料自封袋中，在室溫條件下培養(yǎng)3~7天，即可獲得切梢小蠹伴生菌。免除了過去實驗室內(nèi)采用大量玻璃培養(yǎng)皿等器具，野外伴生菌采樣需要攜帶電鋸，以及受害木段運輸?shù)却罅抗ぷ鳎?/p>

3）將藍(lán)變組織用酒精擦拭局部消毒后，剝離外層組織，直接用藍(lán)變內(nèi)部韌皮組織進(jìn)行伴生菌培養(yǎng)，可減少藍(lán)變外層韌皮組織上的雜菌污染。