[發(fā)明專利]人類ALDH2基因檢測(cè)試劑盒

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510359801.1
• 申請(qǐng)日: 2015-06-26
• 公開（公告）號(hào): CN104878119A
• 公開（公告）日: 2015-09-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊功達(dá);曾豐波;胡秀弟;李勝彬
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 上海光華專利事務(wù)所 31219
• 代理人: 郭婧婧;許亦琳

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種人類ALDH2基因檢測(cè)試劑盒。

背景技術(shù)

乙醛脫氫酶2(ALDH2)在人體的酒精代謝過程中起到重要作用。當(dāng)人攝入酒精后，體內(nèi)的乙醇脫氫酶首先將其氧化為乙醛，然后通過ALDH2把乙醛進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成為乙酸。乙醛對(duì)身體有較強(qiáng)的毒性，一旦乙醛脫氫酶發(fā)生突變，將會(huì)影響身體降解乙醛的效率，導(dǎo)致乙醛在體內(nèi)累積，從而引發(fā)身體不適，長(zhǎng)此以往將會(huì)造成對(duì)肝臟、腎臟和心臟的負(fù)擔(dān)，從而引發(fā)各類疾病。有研究表明，乙醛脫氫酶2的突變與各類消化道癌癥的關(guān)系密切。同時(shí)，乙醛脫氫酶2還是有效代謝硝酸甘油的關(guān)鍵，而乙醛脫氫酶2突變的人群服用硝酸甘油無效風(fēng)險(xiǎn)大幅增加，所以在服用硝酸甘油前需要進(jìn)行乙醛脫氫酶2基因檢測(cè)，如果檢測(cè)結(jié)果表明受檢者服用硝酸甘油無效，則需要改用其它藥物。

現(xiàn)有技術(shù)中，已有檢測(cè)ALDH2基因突變的技術(shù)。例如：(1)采用基因芯片的方法進(jìn)行ALDH2基因突變檢測(cè)，該技術(shù)在野生型和突變型的堿基差異位置設(shè)計(jì)寡核苷酸序列，通過是否能與芯片雜交來判別檢測(cè)對(duì)象為野生型還是突變型。基于基因芯片的技術(shù)步驟繁瑣，每個(gè)樣本的處理時(shí)間較長(zhǎng)，很難進(jìn)行大樣本量的批量處理，而且單次檢測(cè)的成本較高，同時(shí)還需要芯片掃描儀來進(jìn)行診斷，需要購(gòu)置額外的檢測(cè)設(shè)備。(2)采用一代測(cè)序的方法來區(qū)分野生型和突變型，所述技術(shù)需要一代測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序，同時(shí)實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)。(3)采用QPCR的方法來區(qū)分野生型和突變型，但是所述技術(shù)需要QPCR儀進(jìn)行測(cè)序，操作復(fù)雜。(4)用特異性的引物進(jìn)行PCR來區(qū)分野生型和突變型，但是所述技術(shù)的準(zhǔn)確率低。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中所存在的缺陷，本發(fā)明的目的在于，提供一種檢測(cè)快速、準(zhǔn)確率高、操作簡(jiǎn)單、成本低的ALDH2基因檢測(cè)試劑盒。

本發(fā)明的另一目的在于，提供所檢測(cè)試劑盒應(yīng)用及其使用方法。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

本發(fā)明的第一方面，提供了一種ALDH2基因檢測(cè)試劑盒，包括野生型和突變型ALDH2基因特異性擴(kuò)增引物對(duì)以及TspRI限制性內(nèi)切酶。

優(yōu)選地，所述引物對(duì)包括正向引物和反向引物，正向引物的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.3所示，具體為：5’-TGTAACCCATAACCCCCAAG-3’；反向引物的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.4所示，具體為：5’-AAACACTGATGGCCTCAAGC-3’。

本發(fā)明試劑盒的關(guān)鍵是所述引物對(duì)和所述限制性內(nèi)切酶的首次組合使用。本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)過反復(fù)比較和優(yōu)化，獲得了所述能同時(shí)擴(kuò)增野生型和突變型ALDH2基因的引物對(duì)。根據(jù)野生型和突變型ALDH2基因的單堿基差異位點(diǎn)，設(shè)計(jì)了所述TspRI限制性內(nèi)切酶，野生型ALDH2基因能夠被所述限制性內(nèi)切酶識(shí)別并消化，而突變型ALDH2基因?qū)λ鱿拗菩詢?nèi)切酶不敏感，因此不能夠被識(shí)別消化。將消化后的產(chǎn)物直接進(jìn)行電泳，若電泳結(jié)果只有一個(gè)完整的400bp左右的條帶，則說明受試者的ALDH2基因的兩個(gè)拷貝都不能被TspRI限制性內(nèi)切酶消化，為純合突變型ALDH2基因；若電泳結(jié)果有兩個(gè)被消化的條帶，則受試者的ALDH2基因的兩個(gè)拷貝均能夠被TspRI限制性內(nèi)切酶消化，為野生型ALDH2基因；若電泳結(jié)果有三個(gè)條帶(其中有一條400bp左右的未被消化的條帶以及兩條被消化的條帶)，則受試者的ALDH2基因有一個(gè)拷貝能夠被TspRI限制性內(nèi)切酶消化，一個(gè)不能夠被TspRI限制性內(nèi)切酶消化，為雜合突變型ALDH2基因。

基于本發(fā)明的所述試劑盒采用的是PCR來進(jìn)行定量檢測(cè)，所述試劑盒中還可以包括其他一些試劑，如：總DNA抽提試劑、PCR試劑、PCR產(chǎn)物純化試劑、凝膠電泳試劑以及對(duì)照品中的一種或多種。具體需要將哪些試劑裝配入試劑盒，可以根據(jù)實(shí)際需要配置。

所述總DNA抽提試劑可采用各種常規(guī)的抽提DNA的試劑，這些試劑可市購(gòu)獲得。

所述PCR試劑可采用各種常規(guī)的PCR試劑，這個(gè)試劑可市購(gòu)獲得。

所述PCR產(chǎn)物純化試劑可采用各種常規(guī)的PCR產(chǎn)物純化試劑，這個(gè)試劑可市購(gòu)獲得。

所述對(duì)照品包括野生型ALDH2基因陽性對(duì)照樣品、純合突變型ALDH2基因陽性對(duì)照樣品、雜合突變型ALDH2基因陽性對(duì)照樣品。

所述試劑盒還包括陰性對(duì)照品，所述陰性對(duì)照品為ddH₂O。

此外，所述的試劑盒中還包括使用說明書，便于本領(lǐng)域技術(shù)人員使用。

進(jìn)一步的，本發(fā)明的第二方面，還提供了一種前述試劑盒的使用方法，包括步驟：