[發(fā)明專利]BRCA1蛋白在制備逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞對(duì)MTX耐藥性的藥物中的應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510319265.2
• 申請(qǐng)日: 2015-06-11
• 公開（公告）號(hào): CN104946755B
• 公開（公告）日: 2017-07-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孟祥寧;蔡夢(mèng)迪;李春香;朱靜;劉鵬;高巍;關(guān)榮偉;侯麗青
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;G01N33/573
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司11139
• 代理人: 孫皓晨,韓小雷

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及BRCA1蛋白在制備逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞對(duì)MTX耐藥性的藥物中的應(yīng)用，具體涉及BRCA1蛋白在制備通過下調(diào)DHFR基因擴(kuò)增進(jìn)而逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞對(duì)MTX耐藥性的藥物中的應(yīng)用，屬于腫瘤生物治療技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

氨甲蝶呤(Methotrexate,MTX)是惡性腫瘤治療中的一個(gè)有效的抗代謝藥，是目前腫瘤治療中應(yīng)用最廣泛的葉酸拮抗劑，能競(jìng)爭性地結(jié)合二氫葉酸還原酶(Dihydrofolatereductase,DHFR)，抑制核苷酸代謝，從而阻斷DNA的合成、特異性地殺傷增殖期細(xì)胞。雖然MTX已成為腫瘤治療的常用藥物，但是，由于長時(shí)間的用藥會(huì)導(dǎo)致耐藥性的產(chǎn)生，從而嚴(yán)重影響藥物的療效，所以克服MTX耐藥是提高其腫瘤治療療效的關(guān)鍵。

MTX耐藥分為先天耐藥和獲得性耐藥。其中MTX獲得性耐藥的機(jī)制可以概括為以下三類：第一、還原性葉酸載體(Reduced folate carrier,RFC)的缺失或功能缺陷致使MTX的攝入量減少；第二、胞內(nèi)多聚谷氨酸合成酶(Folylpolyglutamate synthetase,FPGS)活性下降或表達(dá)降低導(dǎo)致氨甲蝶呤多聚谷氨酸化水平下降，產(chǎn)生耐藥；第三、MTX的靶酶DHFR水平升高導(dǎo)致的耐藥，DHFR表達(dá)增強(qiáng)通常是由DHFR基因擴(kuò)增引起的。

基因擴(kuò)增是指細(xì)胞內(nèi)部某些基因的拷貝數(shù)專一性大量增加的現(xiàn)象，是基因組不穩(wěn)定性的一種主要形式。基因擴(kuò)增會(huì)形成兩種主要的細(xì)胞遺傳學(xué)結(jié)構(gòu)，即染色體外元件雙微體(Double minutes,DMs)及染色體上的異常結(jié)構(gòu)均質(zhì)染色區(qū)(Homogeneous staining regions,HSRs)。1962年，人們首次在結(jié)腸癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)DMs。DMs是染色體外成對(duì)環(huán)狀，能自主復(fù)制的染色小體。DMs沒有著絲粒，在細(xì)胞分裂中隨機(jī)分配，正因?yàn)槿绱耍珼Ms隨時(shí)面臨著丟失的風(fēng)險(xiǎn)。但是，DMs本身帶有的擴(kuò)增基因或者與耐藥相關(guān)的基因能為細(xì)胞本身提供生長優(yōu)勢(shì)，因此在群體中會(huì)出現(xiàn)DMs逐漸增多的現(xiàn)象。人們最早在人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系及耐MTX的中國倉鼠細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)了均質(zhì)染色區(qū)。應(yīng)用G顯帶技術(shù)發(fā)現(xiàn)一段缺乏典型帶紋的染色體片段，并稱其為均質(zhì)染色區(qū)或異常顯帶區(qū)域。

研究發(fā)現(xiàn)，包含DHFR耐藥基因的DMs數(shù)量減少會(huì)逆轉(zhuǎn)細(xì)胞對(duì)MTX的耐藥情況。而目前DMs減少的機(jī)制還不十分明確。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期結(jié)果及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，我們推測(cè)使DMs數(shù)量減少的原因主要有以下兩種：第一，DMs轉(zhuǎn)化為HSRs；第二，DMs以微核形式外排。目前研究表明，微核外排具有典型的細(xì)胞周期依賴性，主要發(fā)生在G₀期和M期。因此，細(xì)胞周期進(jìn)程加快可能導(dǎo)致微核外排量增加，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)DMs數(shù)量的減少。

基因擴(kuò)增產(chǎn)生的前提條件是DNA雙鏈斷裂(double strands break，DSB)的發(fā)生。在此基礎(chǔ)上，細(xì)胞對(duì)于DSB的修復(fù)能力異常增加。DSB修復(fù)主要存在兩種機(jī)制，同源重組修復(fù)(homologous recombination repair，HR)是其中較為精確的修復(fù)機(jī)制。因此，HR的異常表達(dá)可能會(huì)影響腫瘤細(xì)胞中基因擴(kuò)增的程度。

HR的主要參與蛋白包括：PI3K家族成員ATM、剪切酶復(fù)合體MRN(MRE11/RAD50/NBS1)、BRCA1、BRCA2、RAD51及其類似物家族、RAD52、RAD54、RecQ解旋酶等。其中，BRCA1是重要的核心分子之一。研究發(fā)現(xiàn)，BRCA1不僅可競(jìng)爭性抑制53BP1，啟動(dòng)HR；它還能與MRN復(fù)合體相結(jié)合完成DNA末端的剪切；促進(jìn)RAD51的募集以保證鏈入侵的順利進(jìn)行；此外，它還能夠影響細(xì)胞周期檢查點(diǎn)，是細(xì)胞周期的重要調(diào)控因子。本研究針對(duì)BRCA1進(jìn)行干擾后發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)DSB累積急劇增加；研究還發(fā)現(xiàn)，干擾BRCA1能夠加快細(xì)胞周期進(jìn)程，使含有DHFR擴(kuò)增基因的微核外排增多，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)DHFR基因劑量減少，細(xì)胞對(duì)MTX的耐藥能力降低，進(jìn)而逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的耐藥情況，為腫瘤治療提供新的靶點(diǎn)，為有效地對(duì)抗MTX耐藥提供科學(xué)依據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)腫瘤治療藥物MTX在治療過程中常常產(chǎn)生耐藥而導(dǎo)致化療失敗甚至疾病復(fù)發(fā)的現(xiàn)象，本發(fā)明提供了BRCA1蛋白在制備逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞對(duì)MTX耐藥性的藥物中的應(yīng)用，具體涉及BRCA1蛋白在制備通過下調(diào)DHFR基因擴(kuò)增進(jìn)而逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞對(duì)MTX耐藥性的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述腫瘤細(xì)胞為對(duì)MTX的耐受程度為10^-4mol/LMTX的人結(jié)腸癌細(xì)胞。