[發明專利]臍帶血單個核細胞來源的DC-CIK細胞制取方法及制劑

在審

• 申請號: 201510316136.8
• 申請日: 2015-06-10
• 公開（公告）號: CN105112371A
• 公開（公告）日: 2015-12-02
• 發明（設計）人: 章毅;李春麗;朱華;陳亮
• 申請（專利權）人: 中國干細胞集團上海生物科技有限公司;重慶市干細胞技術有限公司;陜西省干細胞技術有限公司;蘇州市干細胞技術有限公司;上海市干細胞技術有限公司;三亞市干細胞技術有限公司;中國干細胞集團上海有限公司;中國干細胞集團重慶有限公司;中國干細胞集團陜西有限公司;中國干細胞集團三亞有限公司;章毅
• 主分類號: C12N5/0784
• 分類號: C12N5/0784;C12N5/0783;A61K35/15;A61K35/17;A61P35/00
• 代理公司: 上海序倫律師事務所 31276
• 代理人: 包文超

1.一種DC細胞制取方法，其特征在于將分離自臍帶血的單個核細胞分別進行分化成成熟的DC細胞。

2.根據權利要求1所述的DC細胞制取方法，其特征在于先由GM-CSF、IL-4和Flt3L因子分化24小時～48小時獲得未成熟的DC細胞，然后再由TNF-α、IL-1β、IL-6和PGE2作用于所述未成熟的DC細胞24小時～48小時，獲得所述的成熟的DC細胞。

3.根據權利要求2所述的DC細胞制取方法，其特征在于所述的GM-CSF用量為20ng/ml～30ng/ml。

4.根據權利要求2所述的DC細胞制取方法，其特征在于IL-4用量為10ng/ml～20ng/ml。

5.根據權利要求2所述的DC細胞制取方法，其特征在于所述的Flt3L用量為45ng/ml～55ng/ml。

6.根據權利要求2所述的DC細胞制取方法，其特征在于所述的TNF-α用量為95ng/ml～105ng/ml。

7.根據權利要求2所述的DC細胞制取方法，其特征在于所述的IL-1β用量為5ng/ml～15ng/ml。

8.根據權利要求2所述的DC細胞制取方法，其特征在于所述的IL-6用量為5ng/ml～15ng/ml。

9.根據權利要求2所述的DC細胞制取方法，其特征在于所述的PGE2用量為0.3μg/ml～3μg/ml。

10.根據權利要求1所述的DC細胞制取方法，其特征在于獲取所述的成熟的DC細胞步驟包括：

將4×10⁶個/ml～5×10⁶個/ml取自臍帶血的單個核細胞置于37℃，5％CO₂培養箱中孵育2小時后吸出懸浮細胞，清洗貼壁細胞，于培養基中加入因子GM-CSF至濃度25ng/ml，加入IL-4至濃度16ng/ml和加入Flt3L至濃度50ng/ml分化24小時～48小時，期間保持GM-CSF、IL-4和Flt3L終濃度穩定，獲得未成熟的DC細胞；

再使用100ng/mlTNF-α、10ng/mlIL-1β、10ng/mlIL-6和1μg/mlPGE2作用于所述的未成熟的DC細胞24小時～48小時獲得所述的成熟的DC細胞。

11.根據權利要求10所述的DC細胞制取方法，其特征在于所述的培養基為以無血清淋巴細胞培養液為基礎培養基。

12.根據權利要求10所述的DC細胞制取方法，其特征在于所述的培養基為以無血清淋巴細胞培養液為基礎培養基，還加入臍帶血血漿至濃度0.5v/v～1v/v％。

13.一種根據權利要求1～12所述的方法獲得DC細胞在制備腫瘤的免疫治療藥物中的應用。

14.一種根據權利要求1～12所述的方法獲得DC細胞與CIK細胞共培養。

15.一種根據權利要求1～12所述的方法獲得DC細胞與CIK細胞按1∶10～100共培養。

16.一種DC-CIK共培養細胞制取方法，其特征在于將權利要求1～12所述的方法獲得的DC細胞與分離自臍帶血的單個核細胞分化成的CIK細胞進行共培養，獲得DC-CIK共培養細胞。

17.根據權利要求16所述的DC-CIK共培養細胞制取方法，其特征在于所述的單個核細胞是采用Ficoll密度梯度離心法分離，經紅細胞裂解液裂解后，用生理鹽水清洗，低速離心后獲得。

18.根據權利要求16所述的DC-CIK共培養細胞制取方法，其特征在于所述的DC細胞和CIK細胞由來自同一份臍帶血單個核細胞的貼壁細胞和懸浮細胞分別培養得到。

19.根據權利要求16所述的DC-CIK共培養細胞制取方法，其特征在于所述的DC細胞和CIK細胞按1∶10～100進行共培養，培養時間為7天～10天，保持IL-2濃度95ng/ml～105ng/ml穩定。

20.根據權利要求16所述的DC-CIK共培養細胞制取方法，其特征在于獲得的DC-CIK共培養細胞具有CD3+和CD56+免疫表型。