[發(fā)明專利]豬偽狂犬病毒和/或豬圓環(huán)病毒2型的可視化基因芯片以及試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510313807.5
• 申請日: 2015-06-09
• 公開（公告）號: CN104894294B
• 公開（公告）日: 2017-11-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 文心田;曹三杰;常曉霞;黃小波;文翼平;伍銳;張仙;馬銳;楊國淋
• 申請（專利權(quán)）人: 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 成都高遠(yuǎn)知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙)51222
• 代理人: 李高峽,張娟

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種檢測豬偽狂犬病毒和/或豬圓環(huán)病毒2型的可視化基因芯片以及檢測方法。

背景技術(shù)

隨著我國養(yǎng)豬業(yè)向集約化和規(guī)模化方向發(fā)展，規(guī)模化豬場疫病多發(fā)、多種病原混合感染較普遍存在，給養(yǎng)豬業(yè)造成了一定損失。其中豬偽狂犬病毒(PRV)、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)是引起豬繁殖障礙的兩種重要疫病病原。這兩種病臨診癥狀相似，需要進(jìn)行鑒別診斷。

目前，對這兩種疾病的診斷多采用分離鑒定及常規(guī)的血清學(xué)方法，所需時間較長，也有PCR技術(shù)的鑒別方法，但還沒有建立操作性強(qiáng)且能同時鑒別兩種病毒的方法。因此，有必要建立能同時進(jìn)行兩種疫病快速檢測的方法。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種特異性強(qiáng)、靈敏度高、可同時檢測豬偽狂犬病毒和/或豬圓環(huán)病毒2型的可視化基因芯片和試劑盒。

基因芯片，是指指通過不同方法將生物分子(寡核苷酸、cDNA、genomic DNA、多肽、抗體、抗原等)固著于硅片、玻璃片(珠)、塑料片(珠)、凝膠、尼龍膜等固相遞質(zhì)上形成的生物分子點(diǎn)陣，其突出的特點(diǎn)是微型化、集成化、平行化和高通量。

本發(fā)明檢測豬偽狂犬病毒和/或豬圓環(huán)病毒2型的基因芯片，它包括固相載體以及固定在固相載體上的探針；所述探針包括SEQ ID NO：1和/或3所示基因片段，用于分別檢測偽狂犬病毒和/或豬圓環(huán)病毒2型。

優(yōu)選地，它還包括SEQ ID NO：2所示所示探針，用于檢測偽狂犬病毒野毒株。

其中，它還包括質(zhì)控探針，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4和/或SEQ ID NO：5所示。

本發(fā)明檢測豬偽狂犬病毒和/或豬圓環(huán)病毒2型的試劑盒，它包括前述的基因芯片以及擴(kuò)增試劑；其中，擴(kuò)增試劑包括SEQ ID NO：6～7、SEQ ID NO：10～11所示引物對，用于擴(kuò)增偽狂犬病毒野毒株的基因。

優(yōu)選地，它還包括SEQ ID NO：8～9所示引物對，用于擴(kuò)增偽狂犬病毒野毒株的基因。

優(yōu)選地，所述SEQ ID NO：6、8、10所示上游引物標(biāo)記有生物素。

本發(fā)明還提供了SEQ ID NO：1、3所示基因片段在制備檢測豬偽狂犬病毒和/或豬圓環(huán)病毒2型的基因芯片的用途。

優(yōu)選地，所述基因芯片還包括SEQ ID NO：2所示所示探針，用于檢測偽狂犬病毒野毒株。

本發(fā)明還提供了SEQ ID NO：6～7、SEQ ID NO：10～11所示引物對以及SEQ ID NO：1、3所示基因片段在制備檢測豬偽狂犬病毒和/或豬圓環(huán)病毒2型中的用途；其中，兩對引物對為擴(kuò)增試劑，SEQ ID NO：1或3所示基因片段為檢測探針。

優(yōu)選地，所述基因芯片還包括SEQ ID NO：2所示所示探針以及SEQ ID NO：8～9所示引物對，用于檢測和擴(kuò)增偽狂犬病毒野毒株的基因。

本發(fā)明基因芯片和試劑盒可以有效檢測豬偽狂犬病毒和豬圓環(huán)病毒2型，還能區(qū)分豬偽狂犬病毒的疫苗株與野毒株感染，具有特異性好、靈敏性高和保存期長等特點(diǎn)，耗時短，檢測快速，檢測結(jié)果的觀察直觀，無需昂貴的設(shè)備，可以迅速掌握畜禽疫病的感染情況，臨床應(yīng)用前景良好。

以下通過實(shí)施例形式的具體實(shí)施方式，對本發(fā)明的上述內(nèi)容作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)施例。凡基于本發(fā)明權(quán)利要求書記載的內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。

附圖說明

圖1：陣列排布示意圖

圖2：點(diǎn)陣設(shè)置圖示

圖3：樣品設(shè)置圖示

圖4：芯片預(yù)雜交的組裝圖示

圖5：芯片特異性檢測結(jié)果A:PRV檢測結(jié)果；B:PPV檢測結(jié)果；C:PCV2檢測結(jié)果；D:PRV+PPV檢測結(jié)果；E:PRV+PPV檢測結(jié)果；F:PRV+PCV2檢測結(jié)果

圖6：gB探針基因不同稀釋度芯片靈敏性檢測結(jié)果

圖7：gE探針基因芯片靈敏性檢測結(jié)果

圖8：ORF2探針基因芯片靈敏性檢測結(jié)果

圖9：穩(wěn)定性檢測結(jié)果

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1本發(fā)明檢測方法

一、探針基因的設(shè)計(jì)以及包含探針的質(zhì)粒菌的構(gòu)建

1材料

1.1種毒

PRV Fa株，由衛(wèi)生部成都生物制品研究所惠贈；

PCV2由本實(shí)驗(yàn)室趙春容從四川資陽病料中分離；

豬細(xì)小病毒滅活疫苗購自北京中海科技動物保健科技公司。

1.2探針基因重組質(zhì)粒菌