[發明專利]一種重組耶氏解脂酵母菌株及其構建方法和應用

有效

• 申請號: 201510278974.0
• 申請日: 2015-05-27
• 公開（公告）號: CN104805027B
• 公開（公告）日: 2018-04-27
• 發明（設計）人: 元英進;肖文海;杜昊星;王穎
• 申請（專利權）人: 天津大學
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/81;C12P33/00;C12R1/645
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司11227
• 代理人: 趙青朵

技術領域

本發明涉及基因工程技術領域，更具體的說是涉及一種重組耶氏解脂酵母菌株及其構建方法和應用。

背景技術

人類健康、能源、環境等領域的重大需求牽引著合成生物學的迅猛發展。合成生物技術在合成重要產品、生產清潔能源、維護人類健康等方面均取得了令人矚目的成果。利用合成生物技術構建菜油甾醇人工細胞可以彌補化學法和酶促法的不足，且生產過程綠色清潔，有很大的優勢。將基因原件(啟動子、轉錄調控區域、核糖體結合位點、開放閱讀框、終止子等)依據工程化目標需要，有機重構和連接起來，便形成了功能基因模塊。通過對已有生物網絡加以利用，同時引入新的功能基因模塊，表達出天然細胞不能合成或含量極低的產物。

菜油甾醇作為甾體類藥物的關鍵前體，它的合成具有重要意義。菜油甾醇作為一般的植物甾醇是在植物中提取的，但植物提取周期長，副產物和污染較大。微生物中目前尚無菜油甾醇作為產物的合成報道，但有以此為中間產物最終合成黃體酮和氫化可的松的研究。

目前人們對解脂酵母的研究愈來愈多，解脂酵母作為一種非常規的安全酵母被更多的拿來生產。解脂酵母在生產檸檬酸，脂肪酸以及番茄紅素上都有巨大的優勢。由于解脂酵母中的油滴比釀酒酵母大，所以可以更好的容納一些疏水產品，這些疏水產品儲存在油滴中減輕對細胞的毒害作用。解脂酵母可以將很多物質作為自己的碳源，并且在各種碳源中都能獲得較大的生物量。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的在于提供一種重組耶氏解脂酵母菌株，使得所述菌株能夠應用于菜油甾醇的生物合成中，并保持較高產量，同時提供所述菌株的構建方法。

為實現上述發明目的，本發明提供如下技術方案：

一種重組耶氏解脂酵母菌株，基因組包含SEQ ID NO:1-3任意一項所示的核苷酸序列。

本發明將包含蟾蜍、水稻或褐家鼠來源的基因dhcr7基因的核苷酸序列利用耶氏解脂酵母自身的同源重組，整合到耶式解脂酵母基因組erg5位點上，獲得所述重組耶氏解脂酵母菌株，具體的核苷酸序列如SEQ ID NO:1-3，三者區別在僅于dhcr7基因來源不同，依次為褐家鼠來源、水稻來源和蟾蜍來源。

同時，本發明還提供了所述重組耶氏解脂酵母菌株的構建方法，包括

步驟1、將SEQ ID NO:4所示、SEQ ID NO:5所示或SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列連接到由啟動子和終止子組成的表達盒中，獲得單基因表達盒；

步驟2、將SEQ ID NO:7所示、SEQ ID NO:8所示和SEQ ID NO:9的核苷酸序列通過OE-PCR連接，獲得片段1，SEQ ID NO:8所示和SEQ ID NO:9的核苷酸序列均位于SEQ ID NO:7所示核苷酸序列下游，SEQ ID NO:9所示核苷酸序列位于SEQ ID NO:8所示核苷酸序列下游；

步驟3、將SEQ ID NO:10所示和SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列通過OE-PCR連接，獲得片段2，SEQ ID NO:11所示核苷酸序列位于SEQ ID NO:10所示核苷酸序列下游；

步驟4、將單基因表達盒、片段1以及片段2采用醋酸鋰法進行耶式解脂酵母轉化，然后采用SC-drop培養基進行篩選，獲得所述重組耶氏解脂酵母菌株；

其中，步驟1、步驟2和步驟3不分先后順序。

步驟1中，SEQ ID NO:4所示、SEQ ID NO:5所示以及SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列即為經過優化后的褐家鼠來源、水稻來源和蟾蜍來源的dhcr7基因。作為優選，步驟1包括：

步驟1.1、在SEQ ID NO:4所示、SEQ ID NO:5所示或SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列兩端加上BsaI酶切位點，獲得外源靶基因，并連接到載體上；

選用耶式解脂酵母內源啟動子EXP1和終止子XPR2，在兩者之間構建一對反向BsaI酶切位點組成表達盒，同時在表達盒兩端加上NotI酶切位點，并連接到載體上；

步驟1.2、對連接有外源靶基因的載體和連接有表達盒的載體進行BsaI酶切，將外源靶基因連接到表達盒上，而后進行NotI酶切，獲得單基因表達盒，序列如SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14所示。單基因表達盒具體的合成示意圖見圖1，所述載體優選為pUC57-simple質粒，該質粒可通過金斯瑞公司購買獲得。