[發明專利]一種葛花降糖活性的定量檢測方法

有效

• 申請號: 201510277034.X
• 申請日: 2015-05-27
• 公開（公告）號: CN104849227B
• 公開（公告）日: 2018-08-17
• 發明（設計）人: 吳宿慧;楊寧輝;李寒冰;劉亞敏;李英杰;郭鳳鵬;李竹;張顏語;王晨琳
• 申請（專利權）人: 河南中醫學院
• 主分類號: G01N21/31
• 分類號: G01N21/31
• 代理公司: 鄭州天陽專利事務所(普通合伙) 41113
• 代理人: 聶孟民

1.一種葛花降糖活性的定量檢測評價方法，其特征在于，包括以下步驟：

1）葛花供試藥物的制備：

將葛花藥材凈選，粉碎，加入葛花重量8~12倍的雙蒸水浸泡25~35分鐘，超聲提取15~25分鐘，抽濾，得葛花水提物母液，母液質量濃度為0.1g/mL，即為葛花供試藥物，密封，閉光4℃保存；

2）檢測用溶液的配制：

（1）制備PBS磷酸緩沖液：

將2.0-2.5g K₂HPO₄溶解在100mL雙蒸水中，制成K₂HPO₄母液；稱取3.2-3.6g KH₂PO₄溶解在100mL雙蒸水中，制成KH₂PO₄母液；取K₂HPO₄母液30-31ml、KH₂PO₄母液29-31ml，混勻，得PBS磷酸緩沖液；

（2）制備α-葡萄糖苷酶溶液：

將30U/mg的α-葡萄糖苷酶凍干粉9-11mg溶于28-32ml的PBS磷酸緩沖液中，再加入55-65mg小牛血清白蛋白，混勻成α-葡萄糖苷酶溶液，4℃保存；

（3）制備PNPG溶液：

將85-95mg PNPG溶于28-32ml雙蒸水中，得PNPG溶液；

（4）制備Na₂CO₃溶液：

將10-11g無水Na₂CO₃溶于90-110ml雙蒸水中，得Na₂CO₃溶液；

3）制備對照品溶液：

取對照品40~60mg，溶于0.5~1.5ml雙蒸水中，離心，取上清，即得對照品溶液；所述的對照品為阿卡波糖；

4）測定葛花對α-葡萄糖苷酶活性抑制率：

在樣品管中加入葛花供試藥物0.05~0.2ml和PNPG溶液0.4~0.6ml，混勻；在空白管中加入PBS磷酸緩沖液0.05~0.2ml和PNPG溶液0.4~0.6ml，混勻；在背景管中加入PBS磷酸緩沖液0.3~0.4ml、對照品溶液0.05~0.2ml和PNPG溶液0.4~0.6ml，混勻；然后將上述溶液在35~40℃保溫8~12min，向空白管和樣品管中分別加入α-葡萄糖苷酶0.2~0.3ml，35~40℃保溫 18~22min；向空白管、樣品管和背景管中加入Na₂CO₃溶液0.4~0.6ml，靜置4~6min，從上述管中分別取180~220μl 溶液置于96孔板中，在波長400nm處用酶標儀分別測定各孔板中溶液的吸光度OD值，每管做3個重復，取平均值計算，并將得到的吸光度OD值代入以下公式計算，得葛花對α-葡萄糖苷酶活性抑制率：

酶活性抑制率=[OD空白組-(OD樣品組-OD背景組)]/OD空白組×100%；

5）效價測定與計算：

根據預實驗與待測樣品葛花的效價估計，對待測樣品與對照品阿卡波糖的加樣量進行調整，調整葛花在0.17mg?mL^-1～0.68mg?mL^-1劑量范圍內，阿卡波糖在0.0025mg?mL^-1～0.0100mg?mL^-1劑量范圍內，當待測樣品與工作對照品在線性范圍內反應曲線呈良好的平行關系，通過可靠性檢驗，即直線回歸P < 0.01, 偏離平行、二次曲線和反向二次曲線P>0.05，平均可信限率 FL%在15%以內，將葛花供試藥物的劑量、對照品的劑量、葛花對α-葡萄糖苷酶活性抑制率、對照品的約定效價值、待測樣品的估計效價值分別輸入中國藥典生物檢定統計程序BS2000進行計算，即得葛花樣品的效價值，實現對葛花質量的評價。