[發(fā)明專利]一種檢測牛流行熱病毒的LAMP方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510273814.7
• 申請日: 2015-05-26
• 公開（公告）號: CN104830999A
• 公開（公告）日: 2015-08-12
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李守軍;韓太光;賈坤;遠(yuǎn)立國;孫凌霜
• 申請（專利權(quán)）人: 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 廣州粵高專利商標(biāo)代理有限公司 44102
• 代理人: 林麗明

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及病原微生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及一種檢測牛流行熱病毒的LAMP方法。

背景技術(shù)

牛流行熱俗稱三日熱或暫時熱，是由牛流行熱病毒引起的一種急性、熱性傳染病。主要侵害奶牛，黃牛次之，水牛很少發(fā)生。該病以發(fā)病急、傳播快、高熱、呼吸道炎癥、四肢關(guān)節(jié)疼痛、行動僵拘等為主要特征。本病在我國主要見于南方，如廣東、廣西、云南、貴州、湖南、湖北、江西、江蘇等省區(qū)常發(fā)，尤其是夏末初秋、高溫季節(jié)較多發(fā)生。目前，在北方地區(qū)也時有本病的流行，給我國養(yǎng)牛業(yè)造成較大的經(jīng)濟(jì)損失。

一般根據(jù)牛流行病學(xué)特征，臨床癥狀和病理變化的特點，可以對該病做出初步診斷。需要確診的，可以借助一些實驗室檢測手段來進(jìn)行，如中和實驗、補(bǔ)體結(jié)合、ELISA、間接免疫熒光實驗來檢測血清中的特異性抗體，但大部分診斷技術(shù)程序繁瑣，檢測的效果也不是很理想；另外也可以在發(fā)熱初期采血進(jìn)行病毒分離，或者用熒光定量PCR的方法檢測特異性抗原，但是，這些檢測技術(shù)的靈敏性都不是很好，而且對實驗條件和設(shè)備的要求比較高。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明為了克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種專一性檢測牛流行熱病毒的LAMP引物。

本發(fā)明的另一個目的是提供一種檢測牛流行熱病毒的LAMP試劑盒。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明是通過以下方案予以實現(xiàn)的：

一種檢測牛流行熱病毒的LAMP引物，由外引物對F3/B3和內(nèi)引物對FIP/BIP組成，引物的序列如SEQ?ID?NO：1~4所示。

現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)存在很多檢測其他病原物的LAMP引物，但是，對于牛流行熱病毒一直都沒有，原因在于，牛流行熱病毒（BEFV）和牛赤羽病病毒（AKV）、牛傳染性支氣管炎病毒（IBRV）、牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）很相似，在檢測的時候很容易出現(xiàn)交叉反應(yīng)，所以，要想設(shè)計一組專一性檢測牛流行熱病毒的LAMP引物非常的困難。本發(fā)明充分分析了牛流行熱病毒基因序列，篩選出相對保守的基因片段，在保守的基因片段中設(shè)計了很多組引物對，最后經(jīng)過逐一篩選發(fā)現(xiàn)，即使是在保守序列中設(shè)計的引物也不一定能夠?qū)Ｒ恍缘臋z測牛流行熱病毒。最后，經(jīng)過大量的引物篩選工作，發(fā)明人終于找到一組可專一性檢測牛流行熱病毒的LAMP引物。

如上所述檢測牛流行熱病毒的LAMP引物在制備牛流行熱病毒檢測試劑盒方面的應(yīng)用。

一種檢測牛流行熱病毒的LAMP試劑盒，包含一組LAMP引物，該引物由外引物對F3/B3和內(nèi)引物對FIP/BIP組成，引物的序列如SEQ?ID?NO：1~4所示。

優(yōu)選地，檢測牛流行熱病毒的LAMP試劑盒的反應(yīng)體系如下：

??Bst?DNA?Polymerase??????1.0μL；

??10×Buffer???????????????2.5μL；

??病毒質(zhì)粒???????????????1.0μL；

??dNTPs?Mix（10mM）????3.0μL；

??MgSO₄（100mM）??????1.0μL；

??甜菜堿（5M）??????????5.0μL；

??FIP/BIP????????????????1.6μM；

??F3/B3??????????????????0.2μM；

??DEPC水???????????????定容至?25μL。

優(yōu)選地，檢測牛流行熱病毒的LAMP試劑盒的LAMP反應(yīng)條件為64℃，反應(yīng)60min，86℃滅活3min，4℃保存。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

本發(fā)明充分分析了牛流行熱病毒基因序列，篩選出相對保守的基因片段，在保守的基因片段中設(shè)計了很多組引物對，最后經(jīng)過逐一篩選發(fā)現(xiàn)，即使是在保守序列中設(shè)計的引物也不一定能夠?qū)Ｒ恍缘臋z測牛流行熱病毒。最后，經(jīng)過大量的引物篩選工作，發(fā)明人終于找到一組可專一性檢測牛流行熱病毒的LAMP引物。并以該引物建立了檢測牛流行熱病毒的LAMP方法，該方法靈敏性、特異性和穩(wěn)定度都很好。

附圖說明

圖1為溫度對LAMP反應(yīng)的影響；M：DL2000?Marker；1：60℃?；2：61℃；3：62℃；4：63℃；5：64℃；6：65℃。