[發(fā)明專利]一株戊糖片球菌P9-5及其篩選鑒定和應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510254622.1
• 申請日: 2015-05-19
• 公開（公告）號: CN104946558A
• 公開（公告）日: 2015-09-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孫軍;郝瑩;趙晗;郭禮強(qiáng);馬榮檜
• 申請（專利權(quán)）人: 孫軍
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N1/02;C12Q1/04;A23L3/3463
• 代理公司: 濟(jì)南舜源專利事務(wù)所有限公司 37205
• 代理人: 尉金洪

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一株微生物、篩選鑒定及應(yīng)用，特別涉及一株戊糖片球菌P9-5、篩選鑒定及在抗單核細(xì)胞增生李斯特氏菌中的應(yīng)用，屬于微生物的檢測及應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（Listeria?monocytogenes）廣泛存在于自然界中，肉類、蛋類、禽類、海產(chǎn)品、乳制品、蔬菜等都已被證實(shí)是單增李斯特氏菌的感染源，該菌在4℃的環(huán)境中仍可生長繁殖，對環(huán)境及理化因素的適應(yīng)能力非常強(qiáng)，耐高溫、耐酸、耐低溫，是冷藏食品威脅人類健康的主要病原菌之一，感染后主要表現(xiàn)為敗血癥、腦膜炎和單核細(xì)胞增多。

隨著近年來世界范圍內(nèi)發(fā)生的多起單核細(xì)胞增生李斯特氏菌引起的中毒事件以及由此而帶來的危害，使得預(yù)防和控制食品中的單增李斯特氏菌成為了人們關(guān)注的熱點(diǎn)。在研究中發(fā)現(xiàn)，某些乳酸菌對單核細(xì)胞增生李斯特氏菌具有抑制活性。乳酸菌是一類能從可發(fā)酵性碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸的革蘭氏陽性菌的統(tǒng)稱，是人和動物腸道正常菌群中的優(yōu)勢菌，不僅具有許多有益的生理功能，而且能夠產(chǎn)生有機(jī)酸、過氧化氫和細(xì)菌素等抑菌物質(zhì)。細(xì)菌素是某些細(xì)菌在代謝過程中通過核糖體合成機(jī)制產(chǎn)生的具有抑菌活性的多肽或前體多肽，產(chǎn)生菌對其自身分泌的細(xì)菌素具有免疫作用。在研究中發(fā)現(xiàn)，某些乳酸菌細(xì)菌素對單增李斯特氏菌具有強(qiáng)烈的抑制作用，因此這類細(xì)菌素引起了人們特別的關(guān)注，這些細(xì)菌素通常都屬于Ⅱa類細(xì)菌素。它經(jīng)濟(jì)、有效、并且不會對環(huán)境造成二次污染，有望從源頭上對單核細(xì)胞增生李斯特氏菌污染加以控制。

到目前為止，國內(nèi)還沒有開發(fā)出成型、經(jīng)濟(jì)的生物制劑產(chǎn)品。生物制劑作為單核細(xì)胞增生李斯特氏菌控制的一種很好的手段急需加以研究和開發(fā)。

發(fā)明內(nèi)容

????本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于針對以上不足，提供一株戊糖片球菌P9-5及其篩選鑒定和應(yīng)用，實(shí)現(xiàn)以下目的：

1、通過篩選抗單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的乳酸菌菌株；抗單核細(xì)胞增生李斯特氏菌菌株的篩選工作，建立合理、有效的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌拮抗乳酸菌株的篩選方法。

2、提高食品及環(huán)境中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌污染的防控水平。

3、為控制單核細(xì)胞增生李斯特氏菌提供更多選擇。

4、提供對單核細(xì)胞增生李斯特氏菌具有拮抗作用的戊糖片球菌P9-5。

5、為出入境食品的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn)檢疫提供可靠有效的檢測手段。

該菌株于2015年3月6日被保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCC，北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏編號：CGMCC?No.10573，分類命名：戊糖片球菌（Pediococcus?pentosaceus）。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：一株戊糖片球菌（Pediococcus?pentosaceus）P9-5，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏編號為：CGMCC?No.10573。

基于以上所述戊糖片球菌（Pediococcus?pentosaceus）P9-5，本發(fā)明提供所述戊糖片球菌（Pediococcus?pentosaceus）P9-5在抗單核細(xì)胞增生李斯特氏菌中的應(yīng)用。

基于以上所述戊糖片球菌（Pediococcus?pentosaceus）P9-5，所述戊糖片球菌（Pediococcus?pentosaceus）P9-5的篩選方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟a：乳酸菌的分離純化；

步驟b：乳酸菌的篩選；

步驟c：抗單核細(xì)胞增生李斯特氏菌菌株的初篩；

步驟d：抗單核細(xì)胞增生李斯特氏菌菌株的復(fù)篩。

一種優(yōu)化方案，所述步驟a包括：稱取樣品25g，加入225ml?MRS液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)48h，混合均勻后分別用微量移液器吸取1ml培養(yǎng)液用生理鹽水稀釋10^-1-10^-6六個梯度，取10^-4，10^-5，10^-6三個濃度各0.1ml涂布MRS平板，37℃培養(yǎng)24h，挑取單菌落純化。

進(jìn)一步地，所述步驟b包括：采用反相高效液相色譜法測定純化后的菌落發(fā)酵液中的乳酸含量；

挑取純化后的菌落于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)48h后，取發(fā)酵液5mL，8000r/min離心10min，除去菌體，加入5mL?0.01mol/L的硫酸水溶液進(jìn)行酸解，離心除去硫酸鈣，以0.22μm的濾膜過濾，取1mL濾液稀釋10倍即得到待測液供上機(jī)檢測；