[發明專利]伊馬替尼免疫原、衍生物及合成方法、特異性抗體和檢測試劑及制備方法

有效

• 申請號: 201510235969.1
• 申請日: 2015-05-11
• 公開（公告）號: CN104804079B
• 公開（公告）日: 2018-07-13
• 發明（設計）人: 虞留明;李振榮;曹永彤;王海濱
• 申請（專利權）人: 蘇州博源醫療科技有限公司
• 主分類號: C07K14/765
• 分類號: C07K14/765;C07K14/795;C07K14/435;C07K16/44;C07D401/04;G01N33/53;G01N33/535
• 代理公司: 南京縱橫知識產權代理有限公司 32224
• 代理人: 董建林

1.一種伊馬替尼免疫原，其結構式如式(Ⅰ)所示：

式中，R為連接基團-(CH₂)_n-COO-，n是1至20之間的整數；載體為具有免疫原性的蛋白質或多肽，選自血清蛋白、血藍蛋白或甲狀腺球蛋白中的一種。

2.一種如權利要求1所述的伊馬替尼免疫原的制備方法，其特征在于包含以下步驟：

(1)將載體蛋白200mg溶解于50ml 0.2M，pH 8.5的磷酸緩沖液中；

(2)將如下化學品加入到小燒杯中攪拌溶解：200mg伊馬替尼衍生物、3.5ml二甲基甲酰胺、3.5ml乙醇、7.0ml 10mM，pH 5.0的磷酸鉀緩沖液、200mg 1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亞胺、50mg N-羥基硫代琥珀酰亞胺，將這些化學品在室溫下攪拌溶解反應30min；

所述的伊馬替尼衍生物，結構式如式(Ⅱ)所示：

上述R為連接基團-(CH₂)_n-COO-，n為1至20之間的整數；

(3)將溶解好的溶液滴加至載體蛋白溶液中，并在2～8℃下攪拌過夜，得到抗原；將合成好的抗原經過透析進行純化，得到伊馬替尼免疫原。

3.一種伊馬替尼衍生物，結構式如式(Ⅱ)所示：

上述R為連接基團-(CH₂)_n-COO-，n為1至20之間的整數。

4.根據權利要求3所述的伊馬替尼衍生物的制備方法，其特征在于，取n＝4時，伊馬替尼衍生物的合成步驟如下：

或者當n為4以外的其余整數時，伊馬替尼衍生物的合成步驟與上述合成步驟的區別僅在于：由化合物5合成化合物7的步驟中，采用的原料6-溴己酸甲酯替換為BrCH₂(CH₂)_nCOOCH₃，n為1至20之間的整數且不為4。

5.一種抗伊馬替尼特異性抗體的制備方法，其特征在于包含以下步驟：

(1)用PBS將連接有牛血清白蛋白的權利要求1所述的伊馬替尼免疫原稀釋至1.0mg/ml，得到抗原溶液，然后用1.0ml抗原溶液與弗氏完全佐劑混合，對實驗動物進行注射；

(2)2～3周后，再用1.0ml相同的抗原溶液與弗氏不完全佐劑對上述實驗動物注射一次，之后每隔四周注射一次，共計注射4次；

(3)對步驟(2)的實驗動物取血，分離純化得到效價為1:30000-1:50000的抗伊馬替尼特異性抗體；所述抗伊馬替尼特異性抗體，是由權利要求1所述的伊馬替尼免疫原免疫實驗動物后產生的完整抗體分子。

6.一種伊馬替尼檢測試劑，含有抗伊馬替尼特異性抗體和指示試劑，所述的指示試劑選自酶試劑；所述的酶試劑由伊馬替尼酶標偶聯物和酶的底物組成，所述伊馬替尼酶標偶聯物為葡萄糖-6-磷酸脫氫酶-半抗原酶標偶聯物，酶的底物為葡萄糖-6-磷酸；所述抗伊馬替尼特異性抗體，是由權利要求1所述的伊馬替尼免疫原免疫實驗動物后產生的完整抗體分子；所述的半抗原為權利要求1所述的伊馬替尼免疫原。

7.一種如權利要求6所述的伊馬替尼檢測試劑的制備方法，其特征在于包含以下步驟：

(1)試劑A：將4.036g、11.25mM氧化態的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸和1.711g、11.25mM葡萄糖-6-磷酸用1L 55mM、pH＝8.0的Tris緩沖液溶解制成均相酶底物；將抗伊馬替尼特異性抗體加到上述均相酶底物中，抗伊馬替尼特異性抗體與均相酶底物的體積比為1:100～1:10000；抗伊馬替尼特異性抗體，是由權利要求1所述的伊馬替尼免疫原免疫實驗動物后產生的完整抗體分子；

(2)試劑B：將伊馬替尼酶標偶聯物加到120mM、pH＝8.2的Tris緩沖液中，伊馬替尼酶標偶聯物與Tris緩沖液的體積比為1:100～1:10000；伊馬替尼酶標偶聯物為葡萄糖-6-磷酸脫氫酶-半抗原酶標偶聯物，所述的半抗原為權利要求1所述的伊馬替尼免疫原。

8.根據權利要求6所述的伊馬替尼檢測試劑的制備方法，其特征在于所述的伊馬替尼酶標偶聯物的制備方法包含以下步驟：

(1)葡萄糖-6-磷酸脫氫酶溶液的制備：稱取15mg規格為100KU的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，室溫溶解于12mL含有72.6mg 0.05M Tris、8mg 3.3mM MgCl₂和100mg NaCl的溶液中，pH＝9.0；在溶液中加入225mg還原態的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸、135mg葡萄糖-6-磷酸以及0.75mL卡必醇；再逐滴加入2mL二甲基亞砜；

(2)伊馬替尼衍生物的激活：在無水狀態下稱取10mg伊馬替尼衍生物，溶解于600μL二甲基甲酰胺中；使上述溶液溫度降到-2～-8℃；加入3μL三丁胺；加入1.5μL氯甲酸異丁酯；-2～-8℃攪拌30分鐘；

所述伊馬替尼衍生物，結構式如式(Ⅱ)所示：

上述R為連接基團-(CH₂)_n-COO-，n為1至20之間的整數；

(3)葡萄糖-6-磷酸脫氫酶與伊馬替尼衍生物的連接：將步驟(2)激活的伊馬替尼衍生物溶液逐滴加入到步驟(1)溶解的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶溶液中；2-8℃攪拌過夜；

(4)純化產物：通過G-25凝膠層析柱純化連接產物，獲得的最終產物為葡萄糖-6-磷酸脫氫酶-半抗原酶標偶聯物，于2-8℃下儲存；伊馬替尼酶標偶聯物為葡萄糖-6-磷酸脫氫酶-半抗原酶標偶聯物，所述的半抗原為權利要求1所述的伊馬替尼免疫原。