[發明專利]一種鑒定藍莓耐熱品種的標記基因及其應用

有效

• 申請號: 201510207933.2
• 申請日: 2015-04-28
• 公開（公告）號: CN104830979B
• 公開（公告）日: 2017-12-26
• 發明（設計）人: 陳文榮;施潔;余柯達;朱心怡;吳潔慧;陳曉青
• 申請（專利權）人: 浙江師范大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/53;C12N15/11
• 代理公司: 青島致嘉知識產權代理事務所(普通合伙)37236
• 代理人: 劉曉

技術領域

本發明涉及一種鑒定藍莓耐熱品種的標記基因o-型硫氧還蛋白(TRXo)及其應用，屬于植物生物技術領域。

背景技術

藍莓(Vaccinium spp.)作為新興水果，具有很高的營養價值與經濟效益，由于藍莓獨特的保健作用，在美國和日本等發達國家是最流行的小水果之一，且被國際糧農組織列為人類五大健康食品之一，堪稱“世界第三代水果之王”。藍莓原產于北方寒冷地區，在亞熱帶地區種植藍莓不但可使其生長期延長，并大大提前了果實成熟期，在國內市場上藍莓正處于高價位時期。但由于亞熱帶地區夏季天氣燥熱，日照強烈，氣溫可高達35～39℃，有時甚至達到40℃以上，對藍莓造成生長停滯，甚至導致其死亡。高溫是限制藍莓生長和產量的主要環境因素之一，近年來，溫室效應導致全球性氣溫上升和中國藍莓產業的南移，對于耐熱藍莓品種的篩選和耐熱新品種的培育顯得尤為重要。而常規田間自然鑒定法，雖然具有操作簡便的特點，但該方法需要栽培幾年后才能評價，并且只有大面積栽培才能保證結果的準確性，因此常常需要耗費大量的人力物力，還存在實驗周期長等缺點。而通過耐熱標記基因對耐熱藍莓品種篩選具有快捷、方便和準確的優點。最近，浙江師范大學藍莓課題組在對高溫脅迫條件下藍莓的生理生化和分子相關指標進行分析時，發現TRXo在不同藍莓品種中能夠穩定的上調表達，且發現耐熱能力越強的藍莓品種上調量越大，這為開發一種鑒定藍莓耐熱品種的分子方法提供了一種思路。

硫氧還蛋白(TRX)是一類廣泛存在于生物體內的多功能酸性蛋白，分子量約12kDa，參與細胞的一系列生化反應。蛋白質中Cys氧化產物的還原需要TRX和NTR進行，且活性氧清除體系中的抗氧化酶富含Cys，TRX可使其還原后恢復清除ROS的活性。TRX中TRXf、m、x、y和z定位于葉綠體，而TRXh不僅存在于細胞質，還存在于內質網和線粒體中，TRXo和NTR則是新近發現的線粒體蛋白。研究表明Trx具有基本的氧化還原功能之外，還有許多其他生物學活性，通過參與若干生理過程而發揮重要的生物學功能，包括調節抗氧化作用、抗脅迫作用、參與細胞凋亡過程和調節轉錄因子DNA結合活性等。研究表明TRX在植物抵抗高溫、干旱和低溫等非生物脅迫中起到非常重要的作用。

發明內容

本發明的目的是針對上述存在的問題提供一種在高溫脅迫下的不同耐熱性藍莓品種中上調表達且程度不同的標記基因o-型硫氧還蛋白(TRXo)的序列引物，并利用該引物進行藍莓品種是否是耐熱品種的鑒定方法，采用實時定量基因擴增熒光檢測技術(qRT-PCR)，對該標記基因在待檢測藍莓品種中的表達量進行檢測和分析，進行鑒定待檢測藍莓品種的耐熱性。

上述目的通過以下技術方案實現：

1.提供一種在高溫脅迫條件下的不同藍莓品種中上調表達且程度不同的標記基因o-型硫氧還蛋白(TRXo)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.針對上述基因的核苷酸序列，進行qRT-PCR引物的設計，SEQ ID No.2和SEQ ID No.3(見表1)。

3.人工模擬氣候45℃熱脅迫處理待檢測藍莓6h，并提取總RNA，逆轉錄成cDNA作為模板；以GAPDH為內參基因(SEQ ID No.4和SEQ ID No.5，見表1)，進行qRT-PCR鑒定。若標記基因在待測藍莓品種葉片中的表達模式為上調表達，且表達量高于5倍及以上，則表明該藍莓品種是耐熱品種。

表1進行qRT-PCR的相關引物