[發明專利]豬RBP4蛋白體外表達及其抗體制備

在審

• 申請號: 201510133999.1
• 申請日: 2015-03-25
• 公開（公告）號: CN104673818A
• 公開（公告）日: 2015-06-03
• 發明（設計）人: 孫麗娜;周虛;陳璐;李純錦;趙云;陳樹雄;劉卓;李萬宏;李洪蛟;于佳鑫
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/12;C07K16/18
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 趙青朵

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及豬RBP4蛋白的體外表達及其抗體的制備。

背景技術

視黃醇結合蛋白(Retinol-Binding?Proteins，RBPs)是體內一種低分子量的載脂蛋白，有四種結構形式，分別為RBP-1、RBP-2、RBP-3和RBP4。其中RBP4是一種主要在肝臟表達的轉運蛋白，主要作用是結合和轉運VitaminA(VA)。隨著對其功能的深入研究，發現許多肝臟外組織也能合成RBP4，如大鼠的卵黃囊，豬、綿羊和奶牛的孕體、子宮、胎盤組織，并且Harney等研究表明，子宮中RBP4的表達水平可能受激素的調節。目前研究表明，RBP4在家畜生產性能，尤其在豬繁殖性能方面具有重要意義，已經成為母豬高產仔數的理想候選基因。研究報道，RBP4基因存在兩種基因型，基因型之間的差異為0.5頭/窩(總產仔數)和0.26頭/窩(產活仔數)。我國學者在一些地方豬種中也發現了顯著影響豬總產仔數和產活仔數的RBP4基因型。RBP4基因除了與繁殖性狀相關以外，也能直接影響動物的胚胎發育。用siRNA干擾技術抑制小鼠RBP4合成后，導致胚胎卵黃血管、腦神經血管和眼部畸形，然而，添加外源RBP4后胚胎發育恢復正常，說明，RBP4在胚胎發育過程中具有重要的調節作用。因此，豬RBP4蛋白體外表達及制備特異性結合豬RBP4蛋白的抗體具有重要的意義。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的在于提供豬RBP4蛋白體外表達及其抗體制備。

為實現本發明的目的，本發明采用如下技術方案：

一種豬RBP4蛋白體外表達的方法，獲得豬RBP4目的基因，將豬RBP4目的基因與表達載體重組后轉化表達宿主菌，誘導豬RBP4蛋白的表達。

在一些實施方案中，所述豬RBP4目的基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。

在一些實施方案中，所述表達載體為pEASY-E1。

在一些實施方案中，所述表達宿主菌為BL21(DE3)pLySs。

在一些實施方案中，所述誘導為宿主菌培養后加入IPTG至終濃度為1mmol/L。

本發明還提供了一種制備豬RBP4蛋白的抗體的方法，以豬RBP4蛋白為抗原免疫家兔獲得豬RBP4蛋白多克隆抗體血清。

在一些實施方案中，所述豬體RBP4蛋白為豬RBP4目的基因體外表達后經純化、復性得到。

在一些實施方案中，所述體外表達為原核表達。

在一些實施方案中，所述純化為鎳柱親和層析純化。

在一些實施方案中，所述復性為尿素溶液透析復性。

本發明還提供了所述制備方法制備的豬RBP4蛋白抗體。

本發明通過Western?Blot實驗驗證所述抗體的特異性，結果顯示本發明所述豬RBP4蛋白抗體特異性好，能夠特異性豬肝臟組織蛋白和純化的豬RBP4蛋白。

本發明還提供了上述豬RBP4蛋白抗體在制備用于檢測豬RBP4蛋白的免疫檢測工具中的應用。

具體地，所述免疫檢測工具為試劑盒、芯片或試紙。

在具體的實施例中，本發明提供了一種免疫組化檢測試劑盒，包括上述豬RBP4蛋白抗體，可檢測組織細胞中RBP4的表達狀況。

與現有技術相比，本發明提供了一種豬RBP4蛋白體外表達的方法以及以表達的蛋白制備豬RBP4蛋白抗體的方法。本發明所述豬RBP4蛋白抗體可與豬肝臟組織蛋白和純化的豬RBP4蛋白特異性結合，特異性好，廣泛適用于各種檢測豬RBP4蛋白的免疫檢測工具。

附圖說明

為了更清楚地說明本發明實施例或現有技術中的技術方案，下面將對實施例或現有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。

圖1示實施例1RBP4基因PCR電泳結果，其中泳道M為2000bp?marker，泳道1為RBP4基因PCR電泳結果；

圖2示實施例110％SDS-PAGE電泳分析結果圖，其中泳道M為蛋白marker、泳道1為BL21(DE3)pLysS空菌體、泳道2為常規LB培養的含表達載體的BL21(DE3)pLysS菌體未誘導組、泳道3為添加1％葡萄糖LB培養的含表達載體的BL21(DE3)pLysS未誘導組、泳道4-5為含pEASY-E1-RBP4的BL21(DE3)pLysS誘導后上清、泳道6-7為含pEASY-E1-RBP4的BL21(DE3)pLysS誘導后沉淀；