[發明專利]一種mir-505雙等位基因敲除的方法

有效

• 申請號: 201510098102.6
• 申請日: 2015-03-05
• 公開（公告）號: CN104651401B
• 公開（公告）日: 2019-03-08
• 發明（設計）人: 周宇荀;鄧倩云;常雪瑩;王斯佳;肖君華;李凱
• 申請（專利權）人: 東華大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/65;C12N15/113
• 代理公司: 上海泰能知識產權代理事務所 31233
• 代理人: 黃志達

1.一種mir-505雙等位基因敲除的方法，包括：

(1)將pIRES-neo2載體經Xho I酶切后，將擴增得到的3’同源臂，通過同源重組的方法插入到pIRES-neo2載體的Xho I位點；然后載體經Nru I酶切后，將擴增得到的5’同源臂，通過同源重組的方法插入到neo-Xho I載體的Nru I位點，得到neo-Xho I-Nru I載體；

(2)將pIRES-neo2載體在克隆位點雙酶切后，將從pEGFP-C1載體上切割下來的EGFP基因插入載體中，得到neo-EGFP載體；載體經Xho I酶切后，將擴增得到的3’同源臂，通過同源重組的方法插入到neo-EGFP載體的Xho I位點；然后載體經Nru I酶切后，將擴增得到的5’同源臂，通過同源重組的方法插入到neo-EGFP-Xho I載體的Nru I位點，得到neo-EGFP-XhoI-Nru I載體；

其中，

步驟(1)和(2)擴增得到3’同源臂的引物為：

EGFP-505-R-F：CCAGCTGGGGCTCGAGGGAGCATCGCCAAGTTCG；

EGFP-505-R–R：CTAGAATGCACTCGAGGCCAGTGCCTCCTTCTGA；

步驟(1)擴增得到5’同源臂的引物為：

EGFP-505-L-F：TTTTGCGCTGCTTCGCGAACGCTTGCGGATGTGATT；

EGFP-505-L–R：CTGGCCCGTACATCGCGATTGGTCCTTGGCTGGTGT；

步驟(2)擴增得到5’同源臂的引物為：505-L-F：TTTTGCGCTGCTTCGCGAAAGAGGGTGAATGCATGGGA；

505-L–R：CTGGCCCGTACATCGCGACTGGAAGCTTGCACATGGTT；

步驟(1)和(2)中的3’同源臂具體為：以HEK293A細胞基因組DNA為模板，利用HotstartTaq酶特異性擴增得到的858bp mir-505基因的3’同源臂；

步驟(1)中的5’同源臂具體為：以HEK293A細胞基因組DNA為模板，利用Hotstart Taq酶特異性擴增得到的1559bp mir-505基因的5’同源臂；

步驟(2)中的5’同源臂具體為：以HEK293A細胞基因組DNA為模板，利用Hotstart Taq酶特異性擴增得到的444bp mir-505基因的5’同源臂；

(3)將CRISPR/Cas系統載體和neo-Xho I-Nru I載體共同轉染哺乳動物細胞，將mir-505基因被外源neo基因替換，通過G418抗性篩選得到mir-505單等位基因敲除細胞；再一次將CRISPR/Cas系統載體和neo-EGFP-Xho I-Nru I載體共同轉染mir-505單等位基因敲除細胞，將另一條mir-505基因被外源EGFP和neo基因替換，挑選得到表達綠色熒光蛋白的細胞即mir-505雙等位基因敲除細胞；具體步驟如下：

實驗前將HEK293A細胞以1.5×10⁵細胞/孔的密度鋪于24孔板中，確保各孔細胞生長狀態良好，密度相仿，待細胞為單層并處于對數中期，細胞匯合度在70％～80％時進行轉染；將neo-Xho I-Nru I載體和CRISPR系統載體共轉染HEK293A細胞，轉染后細胞置于37℃，5％CO₂的培養箱中孵育24小時；24小時后，將細胞消化下來，重新鋪到6孔板中，待細胞貼壁后，加入700ug/ml濃度G418進行抗性篩選；大約每3天更換新鮮培養基和添加新的G418；加藥篩選4周后存活的細胞則為mir-505單等位基因敲除細胞。

2.根據權利要求1所述的一種mir-505雙等位基因敲除的方法，其特征在于：所述步驟(2)中的雙酶切為EcoR V和BamH I雙酶切。

3.根據權利要求1所述的一種mir-505雙等位基因敲除的方法，其特征在于：所述步驟(2)中的EGFP基因插入載體采用T4連接酶酶連的方法插入。