[發(fā)明專利]具有促神經(jīng)干細(xì)胞增殖活性的訶子乙醇提取物及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510097326.5
• 申請日: 2015-03-05
• 公開（公告）號(hào): CN105232590A
• 公開（公告）日: 2016-01-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉慶山;李旭;張偉偉;劉笛
• 申請（專利權(quán)）人: 劉慶山
• 主分類號(hào): A61K36/185
• 分類號(hào): A61K36/185;A61P25/00;A61P9/10;A23L33/105
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• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種提取物在藥物、保健品和食品添加劑領(lǐng)域的應(yīng)用，特別是涉及該提取物的促神經(jīng)干細(xì)胞增殖活性的應(yīng)用。

背景技術(shù)

少數(shù)民族藥物是我國傳統(tǒng)藥物的重要組成部分，其資源豐富，特色鮮明，理論獨(dú)到，凝結(jié)了數(shù)千年來少數(shù)民族勞動(dòng)人民與大自然搏斗、與疾病抗?fàn)幍臒o數(shù)寶貴經(jīng)驗(yàn)。訶子作為一種傳統(tǒng)民族藥物，在中醫(yī)及中國少數(shù)民族傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中有著悠久的應(yīng)用歷史，訶子是藏醫(yī)、蒙醫(yī)常用藥物，被稱為“藏藥之王”，“益于百病，升體溫，助消化，用于隆、赤巴、培根、血病及四種病的合并癥”。據(jù)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，訶子有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。其水提、醇提、丙酮提、乙酸乙酯提、丁醇提等部位提取物均具有抗氧化清除自由基的能力。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證明訶子含有神經(jīng)保護(hù)的活性成分，可以對抗谷氨酸氧自由基等損傷因素對原代神經(jīng)元的損傷。但是，目前對訶子的研究報(bào)道多限于其活性成分提取工藝方面，藥理學(xué)研究明顯不足，仍需深入研究。

神經(jīng)干細(xì)胞具有自我更新、分化的能力。在腦缺血、退行性疾病等神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，神經(jīng)組織受損傷時(shí)不僅使原有神經(jīng)細(xì)胞減少、活力降低而需要神經(jīng)干細(xì)胞的替代修復(fù)，同時(shí)會(huì)導(dǎo)致內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞活性也受到影響。因此，調(diào)控內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖分化與神經(jīng)系統(tǒng)損傷的治療關(guān)系密切。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種訶子提取物，其具有促神經(jīng)干細(xì)胞增殖的活性，具有廣泛的應(yīng)用前景，尤其是在腦卒中的治療中可能具有潛在的臨床價(jià)值。

本提取物來自于傳統(tǒng)藥物訶子的果實(shí)。本實(shí)驗(yàn)室先后經(jīng)過蒸餾水、無水乙醇、乙酸乙酯、正丁醇提取分離得到該提取物。首先以4倍訶子藥材量的蒸餾水浸泡過夜，加熱回流提取3次，分別為2h、1.5h、1.5h，后兩次分別用蒸餾水2倍藥材量，收集提取液。合并三次提取液，8000rpm離心，棄去沉淀，得訶子總提液(H00)。然后加無水乙醇3倍量，充分?jǐn)嚢瑁瑴p壓抽濾，濾液部分旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無醇味，得醇溶性部位(H01)。最后以正丁醇萃取水層，水層與正丁醇體積比為1∶1，萃取6次。剩余水層8000rpm離心，上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后用蒸餾水混懸，冷凍干燥，制備5％～95％的組分，梯度為10％，并進(jìn)行促神經(jīng)干細(xì)胞保護(hù)和增殖活性篩選。

建立起大鼠神經(jīng)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)體系，制備氧糖剝奪/復(fù)供模型，研究樣品對損傷后的體外培養(yǎng)大鼠神經(jīng)干細(xì)胞促增殖作用。不同劑量訶子提取物對抗缺氧后神經(jīng)干細(xì)胞損傷及促增殖的研究結(jié)果如附圖2、3所示，研究結(jié)果表明訶子提取物有明顯的神經(jīng)干細(xì)胞促進(jìn)增殖和抵抗缺糖缺氧損傷的作用。然后，采用光化學(xué)法建立SD大鼠腦梗死模型，我們研究了提取物對各組大鼠的腦組織病理改變，同時(shí)應(yīng)用神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記蛋白Nestin免疫組化對提取物影響神經(jīng)干細(xì)胞在體增殖及機(jī)制進(jìn)行研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如附圖4、5所示，結(jié)果顯示提取物具有改善腦梗死腦組織病變的效果，表明其神經(jīng)保護(hù)作用；此外，Nestin在腦組織中的變化也表明訶子提取物還具有誘導(dǎo)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖、再生的能力。

附圖說明

圖1為神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)、鑒定圖，顯微鏡下觀察體外培養(yǎng)NSCs.A：NSCs常規(guī)培養(yǎng)第7天(200×)B：第3代傳代NSCs克隆球(200×)C：NSCs克隆球Nestin染色，F(xiàn)ITC標(biāo)記(400×)。

圖2為訶子5％-95％乙醇提取物對神經(jīng)干細(xì)胞活力的影響

圖3為75％訶子乙醇提取物促進(jìn)體外培養(yǎng)缺血再灌注損傷后神經(jīng)干細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變.a.正常組b.模型組c.陽性藥組d.高劑量組e.中劑量組f.低劑量組。

圖4為75％訶子乙醇提取物對各組神經(jīng)干細(xì)胞活力的影響

圖5為75％訶子乙醇提取物對各組大鼠大腦皮層病理形態(tài)學(xué)改變的影響.a.假手術(shù)組b.模型組c.陽性藥組d.高劑量組e.中劑量組f.低劑量組。

圖6為75％訶子乙醇提取物對各組大鼠NSCs標(biāo)記蛋白Nestin的影響。A圖為各組大腦皮層Nestin免疫組化結(jié)果(a.假手術(shù)組b.模型組c.陽性藥組d.高劑量組e.中劑量組f.低劑量組)B圖為大鼠皮層Nestin表達(dá)平均吸收光密度值

具體實(shí)施方式

實(shí)施實(shí)例1本發(fā)明5％-95％乙醇提取物對體外神經(jīng)干細(xì)胞增殖能力影響的研究

1實(shí)驗(yàn)材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

一日齡新生Wistar大鼠，2～3g，SPF級(jí)，由北京維通利華有限公司代購，許可證編號(hào)：SCXK(京)2011-0012。

1.2儀器和試劑