[發明專利]一種PRRSV逆轉錄環介導等溫擴增試劑盒及其應用

在審

• 申請號: 201510095356.2
• 申請日: 2015-03-04
• 公開（公告）號: CN104651536A
• 公開（公告）日: 2015-05-27
• 發明（設計）人: 李軍;馮世文;韋祖樟;潘艷;彭昊;陳澤祥;胡帥;楊威;鐘舒紅;謝宇舟
• 申請（專利權）人: 廣西壯族自治區獸醫研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 廣州市紅荔專利代理有限公司 44214
• 代理人: 李珊

技術領域

本發明涉及微生物檢測技術領域，具體說是涉及一種快速、可視化并且可實時定量檢測豬繁殖障礙與呼吸綜合征病毒（PRRSV）的逆轉錄環介導等溫擴增試劑盒及其應用。

背景技術

豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）是20世紀80年代末出現的一種新病，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的一種豬的高度接觸性傳染病，不同年齡、品種和性別的豬均能感染，但以妊娠母豬和1月齡以內的仔豬更易感染。該病以母豬流產，產死胎、弱胎、木乃伊胎以及仔豬呼吸困難、敗血癥、高死亡率為主要特征。PRRS?于1987年在美國的北卡羅來納州首先發現，后迅速向世界各地蔓延，我國在1995年不慎引入。1996年中國學者在國內分離到PRRSV，從而證實了本病在我國的存在。2006年以前，PRRS?在我國一些地方散發，有的地方呈現蔓延和流行的態勢，主要表現為妊娠母豬繁殖障礙及仔豬呼吸困難。自2006年夏季以來，在我國江西、安徽、浙江、湖南、湖北、江蘇等省發生了以體溫高熱不退、皮膚發紅、呼吸困難為主要臨床癥狀的疫病。剖檢變化以彌散性、出血性間質淋巴結和各內臟器官不同程度出血為突出特征，經流行病學調查、病毒分離、基因分析、動物試驗等，最終確定為，高熱病是由豬藍耳病病毒變異株所引起，鑒于其臨床特征不同于經典豬藍耳病病毒，將其命名為高致病性豬藍耳病。

PRRS發病急、傳播快、發病率高、病程長、病死率高等，夏秋季多發，患病豬和帶毒豬是該病的重要傳染源。豬繁殖與呼吸綜合征病毒只感染豬，各種品種、不同年齡和用途的豬均可感染，但以妊娠母豬和1月齡以內的仔豬最易感，肥育豬也會發病。40日齡以內的仔豬病死率高達100%，育肥豬病死率約為50%；在一些地區的豬場，發病率接近100%，病死率在30%～50%，甚至部分豬場的病死率可達80%以上。

豬繁殖與呼吸綜合征病毒主要經呼吸道或通過公豬的精液經生殖道在同豬群間進行水平傳播，也可以通過母子進行垂直傳播，短期內便可波及全群或鄰近群。易感豬也可與帶毒豬直接接觸或與污染有豬繁殖與呼吸綜合征病毒的運輸工具、器械接觸均可受到感染。

藍耳病是一種高度接觸性傳染病，呈地方流行性。豬感染病毒后2～14周均可通過接觸將病毒傳播給其他易感豬，從病豬的鼻腔、糞便及尿中均可檢測到病毒。仔豬感染豬繁殖與呼吸綜合征病毒后，通常1～2周內在血液中可檢測到病毒，甚至到23d還能檢測到該病毒。這表明對個體而言，豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染的活動期一般是比較短的，但是，用感染后23d的豬扁桃體進行涂抹培養，檢測到了豬繁殖與呼吸綜合征病毒，這個重要的發現表明，豬繁殖與呼吸綜合征病毒可存在或“躲藏”在感染豬的某些部位。

豬繁殖與呼吸綜合征是危害我國豬生產的重要疫病，對該疾病密切監測和快速診斷，有利于該病的防治。目前，豬繁殖與呼吸綜合征病毒的檢測技術主要有常規方法和分子生物學方法。常規方法是病毒的分離鑒定，其結果準確可靠，但常規鑒定方法存在操作復雜，需要復雜的儀器設備，所需時間長，以及受影響的因素多等缺點，不利于豬繁殖與呼吸綜合征的快速診斷。分子生物學的方法主要是通過逆轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）方法檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的特異性基因，雖然RT-PCR方法較常規方法快速準確，但需要昂貴的儀器設備，成本較高，在結果判定上需要進行瓊脂糖凝膠電泳，容易造成實驗室污染導致出現假陽性結果，這些問題給基層和現場檢測提出了一大難題。

發明內容

本發明的目的是為了解決基層快速、準確并且實時檢測豬繁殖障礙與呼吸綜合征病毒（PRRSV），提供一種方便基層簡便、快捷準確地檢測PRRSV的試劑盒。為實現本發明目的所使用的技術方案為：

一種PRRSV逆轉錄環介導等溫擴增試劑盒，該試劑盒包括RT-LAMP引物、2×反應緩沖液、EM、熒光目視檢測試劑、超純水和PRRSV?RNA模板，所述的RT-LAMP引物包括外引物F3（SEQ?ID?NO：1）與B3（SEQ?ID?NO：2）、內引物FIP（SEQ?ID?NO：3）與BIP（SEQ?ID?NO：4）和環引物LF（SEQ?ID?NO：5）與LB（SEQ?ID?NO：6）；

其中引物的序列分別為：

F3???TGCTTAGGCTGGAGGGTG

B3??ATGGCACTGCTAGGCAAAT

FIP?GCCCTGAACACATTCAAGGGGGAGCATTGGACCGTCTCTGT

BIP??AGCATAAGGGCGGTCTTGGTTTCAAGGCAGGCAGGATCA