[發(fā)明專利]多重PCR檢測腸道新發(fā)原蟲試劑盒及檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510093500.9
• 申請日: 2015-03-02
• 公開（公告）號: CN104726566B
• 公開（公告）日: 2017-02-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 沈玉娟;曹建平;劉華;袁忠英;姜巖巖;尹建海;王燕娟
• 申請（專利權(quán)）人: 中國疾病預(yù)防控制中心寄生蟲病預(yù)防控制所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/90
• 代理公司: 上海浦一知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司31211
• 代理人: 王函

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)和動物檢疫技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種隱孢子蟲、賈第蟲、環(huán)孢子蟲和微孢子蟲的檢測方法，尤其涉及一種隱孢子蟲、賈第蟲、環(huán)孢子蟲和微孢子蟲的多重PCR檢測方法及試劑盒。此外，本發(fā)明涉及用于同時(shí)檢測隱孢子蟲、賈第蟲、環(huán)孢子蟲和微孢子蟲的引物。

背景技術(shù)

隱孢子蟲、藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(簡稱賈第蟲)、環(huán)孢子蟲和微孢子蟲為人獸共患新發(fā)腸道原蟲，主要介水傳播，引起消耗性腹瀉，是全球面臨的重要公共衛(wèi)生問題，也是人類迄今為止面臨的最困難的問題之一；可暴發(fā)流行，造成嚴(yán)重的突發(fā)公共衛(wèi)生事件。人的感染主要是攝入被卵囊/包囊等污染的飲水和食物，引起的疾病以腹瀉為主要臨床癥狀，呈全球分布，也是艾滋病患者死亡的主要病因之一。免疫功能正常人群感染，常可引起急性、自限性腹瀉，嬰幼兒、免疫功能缺陷或免疫抑制人群感染，可引起慢性消耗性腹瀉，甚至死亡。該類疾病可從動物傳播到人，人傳播到動物，并在動物與動物、人與人之間廣泛傳播，造成重大經(jīng)濟(jì)影響。每年全球有250萬5歲以下的兒童因包括腸道原蟲在內(nèi)的腸道病原體感染引起的腹瀉而死亡。我國隱孢子蟲感染率0.5％～13.5％，賈第蟲為2.52％，環(huán)孢子蟲為0.3～10.6％，其中臨床腹瀉患者環(huán)孢子蟲感染率為1.71～2.47％；上海某醫(yī)院腹瀉患者微孢子蟲的感染率高達(dá)13.49％。其中隱孢子蟲病已被WHO列入全球六大腹瀉病之一，于1986年將隱孢子蟲作為AIDS(艾滋病)患者的一項(xiàng)懷疑指標(biāo)，并被WHO和美國CDC列入新發(fā)傳染病，隱孢子蟲病越來越引起關(guān)注，已被列為美國政府生物恐怖制劑名單的第三位(http://www.nsf.org/consumer/bioterrorism/bioterrorism_agents.asp)，也是其中唯一一種寄生蟲病原。隱孢子蟲、環(huán)孢子蟲是美國FoodNet食源性疾病監(jiān)測十大病原之一，位列第二和第九位；而隱孢子蟲和賈第蟲是我國《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》水質(zhì)必檢指標(biāo)之一，也是我國國家科技重大專項(xiàng)——國家傳染病監(jiān)測技術(shù)平臺監(jiān)測的病原。另外，2013年春夏之交，美國暴發(fā)了因食物污染引起的環(huán)孢子蟲病，遍布25個(gè)州643人感染；且90％以上的環(huán)孢子蟲感染與食物污染有關(guān)。

有資料顯示水中只要含有1個(gè)卵囊就可引起隱孢子蟲病傳播流行。但是國內(nèi)由于對其研究起步較晚，基本仍采用形態(tài)學(xué)檢測，易漏檢、誤檢。快速檢測工具的缺乏，無檢測試劑盒，更無高通量檢測技術(shù)，嚴(yán)重制約了對這類新發(fā)腸道原蟲的監(jiān)測和研究。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，基于不同的分子標(biāo)識，可實(shí)現(xiàn)對該類腸道原蟲的檢測和鑒定。但單一蟲種檢測，成本昂貴，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。自1988年Chamberian首次將多重PCR(Multiplex?PCR)技術(shù)用于人的杜氏營養(yǎng)不良癥(DMD)的檢測，現(xiàn)已用于傳染病的檢測。目前，應(yīng)用多重PCR技術(shù)對感染性疾病病原檢測主要有兩個(gè)方向：一是針對每一種病原的單個(gè)特異基因進(jìn)行多重檢測，可同時(shí)檢測一種或幾種病原體是否存在；二是針對某一病原的多個(gè)基因進(jìn)行多重檢測，可以減少假陽性結(jié)果的出現(xiàn)。

Lee等建立了一種檢測水中隱孢子蟲，微孢子蟲和環(huán)孢子蟲的多重PCR檢測方法(Lee,S.H,Joung,M,Yoon,S,et?al.Multiplex?PCR?detection?of?waterborne?intestinal?protozoa:microsporidia,Cyclospora,and?Cryptosporidium.Korean?J?Parasitol,2010,48(4):297-301)，該方法的最低檢出率是10-100個(gè)卵囊或子孢子；Li等建立了用于檢測隱孢子蟲和賈第蟲的兩重PCR方法(Li?W,Zhang?N,Gong,P,et?al.A?novel?multiplex?PCR?coupled?with?Luminex?assay?for?the?simultaneous?detection?of?Cryptosporidium?spp.,Cryptosporidium?parvum?and?Giardia?duodenalis.Vet?Parasitol,2010,173(1-2):11-18)，并與Luminex液相芯片檢測技術(shù)相結(jié)合，并能檢測出微小隱孢子蟲，該方法的敏感性可檢測至5*10^-6ng?DNA(即0.1個(gè)卵囊/包囊)。目前尚無同時(shí)檢測糞便樣本中隱孢子蟲、微孢子蟲，環(huán)孢子蟲和賈第蟲四種原蟲的多重PCR方法。

發(fā)明內(nèi)容