[發(fā)明專利]多重PCR檢測(cè)腸道新發(fā)原蟲試劑盒及檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510093500.9
• 申請(qǐng)日: 2015-03-02
• 公開（公告）號(hào): CN104726566B
• 公開（公告）日: 2017-02-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 沈玉娟;曹建平;劉華;袁忠英;姜巖巖;尹建海;王燕娟
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國疾病預(yù)防控制中心寄生蟲病預(yù)防控制所
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/90
• 代理公司: 上海浦一知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司31211
• 代理人: 王函

1.一種多重PCR檢測(cè)腸道新發(fā)原蟲試劑盒，其特征在于，其用于同時(shí)檢測(cè)隱孢子蟲、賈第蟲、環(huán)孢子蟲和微孢子蟲，該試劑盒包括如下引物：

隱孢子蟲的特異性引物：

Cry-F：5’-TCAGCTTTAGACGGTAGGGTATTGG-3’，SEQ?ID?NO.1；

Cry-R：5’-CGAGCTTTTTAACTGCAACAACTTT-3’，SEQ?ID?NO.2；

賈第蟲的特異性引物：

Gia-F：5’-AGTGTTGAGATGCTTCAGGACATG-3’，SEQ?ID?NO.3；

Gia-R：5’-GCACGCTTAGCCTTCTTGGC-3’，SEQ?ID?NO.4；

環(huán)孢子蟲的特異性引物：

Cycl-F：5’-GACAGTTGGGGGCATTCGTATTTA-3’，SEQ?ID?NO.5；

Cycl-R：5’-CCCCCAGAACCCAGAGACTTTGAT-3’，SEQ?ID?NO.6；

微孢子蟲的特異性引物：

Micro-F：5’-ACGGAGGCGAAGGCGACACT-3’，SEQ?ID?NO.7；

Micro-R：5’-CTTGCGAGCGTACTATCCCCAGAG-3’，SEQ?ID?NO.8。

2.一種隱孢子蟲、賈第蟲、環(huán)孢子蟲和微孢子蟲的多重PCR檢測(cè)方法，其特征在于，具體步驟包括如下:

(1)隱孢子蟲、賈第蟲、環(huán)孢子蟲和微孢子蟲的蟲體DNA提取；

(2)引物設(shè)計(jì)與篩選；所述設(shè)計(jì)的引物序列為：

隱孢子蟲的特異性引物：

Cry-F：5’-TCAGCTTTAGACGGTAGGGTATTGG-3’，SEQ?ID?NO.1；

Cry-R：5’-CGAGCTTTTTAACTGCAACAACTTT-3’，SEQ?ID?NO.2；

賈第蟲的特異性引物：

Gia-F：5’-AGTGTTGAGATGCTTCAGGACATG-3’，SEQ?ID?NO.3；

Gia-R：5’-GCACGCTTAGCCTTCTTGGC-3’，SEQ?ID?NO.4；

環(huán)孢子蟲的特異性引物：

Cycl-F：5’-GACAGTTGGGGGCATTCGTATTTA-3’，SEQ?ID?NO.5；

Cycl-R：5’-CCCCCAGAACCCAGAGACTTTGAT-3’，SEQ?ID?NO.6；

微孢子蟲的特異性引物：

Micro-F：5’-ACGGAGGCGAAGGCGACACT-3’，SEQ?ID?NO.7；

Micro-R：5’-CTTGCGAGCGTACTATCCCCAGAG-3’，SEQ?ID?NO.8；

(3)質(zhì)粒構(gòu)建；

(4)建立多重PCR方法，對(duì)所設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)條件優(yōu)化，得到最佳多重PCR模式；

(5)按照步驟(4)的PCR反應(yīng)條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增特異性驗(yàn)證；

(6)按照步驟(4)的PCR反應(yīng)條件進(jìn)行PCR敏感性驗(yàn)證；

(7)按照建立的多重PCR方法對(duì)樣本進(jìn)行檢測(cè)和可行性驗(yàn)證。

3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(3)具體為：將隱孢子蟲、賈第蟲、環(huán)孢子蟲和微孢子蟲進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物回收連接到pMD19-T載體，第二天進(jìn)行轉(zhuǎn)化；以單菌落為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，每個(gè)培養(yǎng)板各挑取5個(gè)菌落，每個(gè)樣本接1個(gè)陽性箘落，37℃，過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定，并將PCR結(jié)果正確的質(zhì)粒送測(cè)序。

4.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(4)中，所述的PCR反應(yīng)條件優(yōu)化具體方法為：退火溫度根據(jù)引物合成后參考溫度，選取57℃、60℃進(jìn)行PCR，根據(jù)擴(kuò)增效果確定退火溫度，最后確定最佳的多重PCR模式。

5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟(4)中，退火溫度為60℃。