[發明專利]一種弓形蟲蛋白TgVP1單克隆抗體雜交瘤3A6及單克隆抗體

有效

• 申請號: 201510093458.0
• 申請日: 2015-03-02
• 公開（公告）號: CN104745536B
• 公開（公告）日: 2018-03-09
• 發明（設計）人: 羅樹紅;郝文波;肖斌
• 申請（專利權）人: 南方醫科大學
• 主分類號: C12N5/20
• 分類號: C12N5/20;C07K16/40;G01N33/577;G01N33/573
• 代理公司: 廣州科粵專利商標代理有限公司44001
• 代理人: 莫瑤江

技術領域

本發明涉及細胞工程領域，具體涉及弓形蟲蛋白TgVP1單克隆抗體雜交瘤細胞株3A6及單克隆抗體。

背景技術

V-H+-PPase是一種獨特的質子泵,在多種動植物中都存在。它能夠水解無機焦磷酸鹽的磷酸酐鍵，并利用所釋放的能量轉運質子，產生跨膜的電化學梯度，發揮和質子泵ATP酶類似的作用。V-H+-Ppase能使儲存的能量高效轉化為H+和/或電轉膜梯度，用于多種不同的細胞內轉運過程。V-PPases最早被發現存在于植物和光合細菌中，近期研究表明錐蟲、利什曼原蟲、弓形蟲、惡性瘧原蟲也存在這種酶。值得關注的是，在這些寄生蟲的動物宿主中均不存在這種酶類，因此V-PPases作為寄生蟲病潛在的藥物靶點具有重要的研究價值。弓形蟲的V-PPases主要分布于酸性鈣體及質膜，根據結構和功能的不同可分為兩種類型，VP1和VP2。TgVP1需要K+激活其生物學活性。當弓形蟲入侵細胞時，TgVP1組成圈狀結構分布于弓形蟲外緣，并隨著弓形蟲的侵入在蟲體內遷移。當弓形蟲完成侵襲過程時，TgVP1重新回到弓形蟲的頂端。TgVP1含有17個跨膜域，N端具有信號肽序列，可以指導TgVP1進入弓形蟲的分泌途徑，但具體作用機制尚不明確。有研究表明弓形蟲焦磷酸酶活性可抑制弓形蟲在細胞內的復制。因此，TgVP1有作為潛在的弓形蟲病臨床診斷和治療靶標的可能，制備TgVP1的抗體具有十分重要的意義，可以為該蛋白功能的研究奠定基礎，同時為其作為疾病標志物的可行性提供實驗數據支持。

發明內容

本發明的目的是克服現有技術的不足，提供一種能用于ELISA、western-blot及免疫熒光檢測的抗弓形蟲蛋白TgVP1的單克隆抗體。

為了實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

本發明所述的檢測弓形蟲蛋白TgVP1的抗體是用合成TgVP1抗原多肽作為抗原免疫BALB/c小鼠獲得，并用細胞融合技術獲得產生這種抗體的雜交瘤細胞株3A6，雜交瘤細胞分泌的抗體為IgG1陽性，輕鏈為κ型。所述抗弓形蟲蛋白TgVP1單克隆抗體雜交瘤3A6，于2014年12月16日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCC NO:C2014231。

本發明中弓形蟲蛋白TgVP1的氨基酸序列為EPT25031.1，如SEQ ID NO：1所示。

本發明中弓形蟲蛋白TgVP1的抗原多肽序列如SEQ ID NO：2所示。

所述的保藏號為CCTCC NO：C2014231的雜交瘤細胞株3A6的制備方法是：TgVP1抗原多肽與馬來酰胺活化的匙孔血藍載體蛋白KLH偶聯，經脫鹽純化后作為免疫原與佐劑混合免疫BALB/c小鼠，期間進行兩次以上免疫，取血清效價大于1:10⁵的BALB/c小鼠脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞按常規方法用50％PEG-4000進行融合；用含20％小牛血清的HAT RPMI-1640培養基篩選融合細胞，用TgVP1抗原多肽包被ELISA板，進行ELISA篩選；經過多次有限稀釋，最后獲得穩定分泌抗TgVP1單克隆抗體的雜交瘤細胞株，標記為3A6。應用此株雜交瘤細胞以1×10⁶/只的量注入石蠟預處理的8-10周齡的BALB/c雌性小鼠腹腔，飼養觀察10-14天后小鼠腹部膨大時抽取腹水。采用親和色譜法Protein G Sepharose Fast Flow純化單克隆抗體，以SDS-PAGE鑒定單克隆抗體的純度，純度達到90％以上。

與現有技術相比，本發明具有如下有益效果：

本發明以合成的TgVP1抗原多肽包被ELISA板，通過ELISA法檢測純化抗體的活性，并用此純化抗體對純化的弓形蟲蛋白進行Western-blot證明該抗體可以識別TgVP1蛋白。

本發明將此純化抗體用于進行弓形蟲的免疫熒光染色證明其能識別天然的TgVP1蛋白。此株雜交瘤細胞分泌的單克隆抗體為進一步研究TgVP1功能奠定基礎，同時為其作為疾病標志物的可行性提供實驗數據支持。