[發明專利]一種豬2型鏈球菌細胞壁蛋白抗體檢測方法的建立及其應用

在審

• 申請號: 201510093096.5
• 申請日: 2015-03-02
• 公開（公告）號: CN104762246A
• 公開（公告）日: 2015-07-08
• 發明（設計）人: 胡巧云;熊毅;袁小寧;黃勝斌;何其松;楊榮;李軍;郭建剛
• 申請（專利權）人: 廣西壯族自治區動物疫病預防控制中心;胡巧云
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;G01N33/68;C12R1/19
• 代理公司: 廣西南寧匯博專利代理有限公司 45114
• 代理人: 朱萍球

技術領域

本發明涉及獸醫微生物學及動物免疫學技術領域，具體涉及基于細胞壁蛋白SspA（Subtilisin-like?serine?protease,?SspA，枯草菌素樣絲氨酸蛋白酶）的重組大腸桿菌菌株Escherichia?coli?BL21/pET28a-SspA，及利用該菌株表達的豬2型鏈球菌重組蛋白，建立ELISA檢測方法，適于與豬2型鏈球菌感染抗體的檢測。

背景技術

豬鏈球菌(Streptococcus?suis)是一種能引起人、豬和其他動物感染、發病的重要致病菌。根據莢膜多糖分型，豬鏈球菌有?35?個血清型，即?1/2?型和?1-34?型。其中豬鏈球菌?2型是毒力最強、流行最廣的血清型。豬2型鏈球菌主要引起豬的腦膜炎、支氣管炎、心內膜炎、關節炎、膿腫等疾病,?并可導致斷奶仔豬死亡。人感染鏈球菌后,會引起腦膜炎、心內膜炎、敗血癥和永久性失聰,嚴重時能引起人的死亡。自?1968?年荷蘭首次報道人感染腦膜炎病例后，有?200?多人因感染豬鏈球菌死亡。我國自七十年代以來有二十多個省市已發生或流行，該病在我國廣泛存在并嚴重流行，已成為當前嚴重危害養豬業發展的一種主要疾病，不僅給養豬業造成巨大經濟損失，而且也給人類造成了嚴重危害。

目前對于豬2型鏈球菌的致病機制的研究，主要集中在其毒力因子。已鑒定的豬鏈球菌2?型主要毒力因子有莢膜多糖?(?CPS?)、溶菌酶釋放蛋白?(?MRP?)、細胞外蛋白因子?(?EF?)?、溶血素?(?SLY?)?等?。如谷氨酸脫氫酶?(?GDH?)、38?kDa?蛋白、分泌核酸酶?(?SsnA?)、豬鏈球菌細胞壁蛋白?(?SspA?)等,?以及一些其它的潛在的毒力因子也與豬鏈球菌的毒力相關。由于豬2型鏈球菌的致病機制尚不清楚，尚缺少有效的疫苗和敏感的診斷方法，豬鏈球菌病一直未能得到有效的控制。

為了有效地預防和控制豬鏈球菌2型病，在加強免疫預防的同時，使用特異、敏感、快速、便于操作的診斷方法，為有效預防和控制豬鏈球菌2型的發生提供有力的手段和重要的工具。目前，豬2型鏈球菌的預防控制仍然以滅活疫苗免疫為主，該滅活苗產生的抗體對豬鏈球菌感染起到很好的保護作用。豬鏈球菌血清學抗體的評價方法有如瓊脂擴散試驗及基于全菌、莢膜多糖為抗原的間接?ELISA,?華中農業大學研制了豬?2?型鏈球菌莢膜多糖抗體的免疫試劑盒，并申請并獲得了專利?CN201210245250.2，可用于檢測豬鏈球菌血清抗體，該方法對滅活疫苗和野毒感染產生的抗體均能檢測，無法判斷豬?2?型鏈球菌感染抗體或免疫抗體。

一般來說，表面暴露蛋白和細胞壁附著蛋白常被作為疫苗的候選靶標和血清型診斷試劑。SspA蛋白是通過體內誘導抗原技術鑒定到的，是一種細胞壁蛋白，在感染機體內大量表達，而與免疫血清不能發生反應，因而可能作為一個診斷標識。鑒于SspA蛋白這些特征，本發明采用克隆sspA基因重要的功能域片段，大量表達純化出SspA蛋白，利用該蛋白研制出快速、準確、安全、廉價的鑒別豬2型鏈球菌免疫豬與野毒感染豬的診斷試劑盒，為豬2型鏈球菌的診斷及控制提供強有力的手段和工具。

發明內容

本發明的第一個目的在于獲得一株能夠分泌豬鏈球菌2型細胞壁蛋白的重組大腸桿菌，利用該重組大腸桿菌獲得重組蛋白，利用該重組抗原蛋白制備豬2型鏈球菌血清學抗體檢測方法。

實現本發明目的的技術方案為，申請人通過制備，獲得一株能夠分泌豬鏈球菌2型免疫保護性抗原的重組大腸桿菌（Escherichia?coli）BL21/pET28a-SspA,該菌株已于2014年7月21日送交湖北省武漢市武漢大學內的保藏在中國典型培養物保藏中心（CCTCC），保藏編號為?CCTCC?NO:?M2014344。

所述的抗原枯草菌素樣絲氨酸蛋白酶SspA由序列表SEQ?ID?NO：1所示的核酸序列基因編碼表達得到。

為使本發明技術方案公開完全，本發明重組大腸桿菌（Escherichia?coli）BL21/pET-28a-SspA的構建過程如下：

（1）豬2型鏈球菌基因組DNA的提取

將本實驗室保藏的豬2型鏈球菌接種于含有10%?滅活新生牛血清的?TSA?培養基上，挑取單個菌落接種于?TSB?液體培養基中，置于搖床150?r/min?，37℃?震蕩培養過夜。取?1.0?ml?菌液于1.5?ml?的離心管中，參照TIANGEN公司的細菌基因組DNA提取試劑盒的說明書提取鏈球菌DNA。

（2）目的基因的擴增