[發(fā)明專利]一種構(gòu)建茶樹DNA指紋圖譜的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510089500.1
• 申請(qǐng)日: 2015-02-27
• 公開（公告）號(hào): CN104651515A
• 公開（公告）日: 2015-05-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孫威江;林志坤;陳志丹
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 福建農(nóng)林大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 福州元?jiǎng)?chuàng)專利商標(biāo)代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學(xué)俊

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種構(gòu)建茶樹DNA指紋圖譜的方法，屬于茶葉分子生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

茶樹（Camellia?sinensis（L.）O.Kuntze）屬山茶科山茶屬茶亞屬茶種植物，起源于我國(guó)西南地區(qū)，經(jīng)長(zhǎng)期的引種、傳播，我國(guó)茶樹生長(zhǎng)區(qū)域從N?18°30′-35°13′，E94°-122°，南至熱帶邊緣，北至暖溫帶。我國(guó)是茶樹的主要原產(chǎn)地，至今已有3000多年的人工栽培歷史，經(jīng)過(guò)幾千年的人工或自然育種，形成了非常豐富的茶樹種質(zhì)資源。目前，在國(guó)家茶樹種質(zhì)資源圃已保存近4000份茶樹種質(zhì)，各省、區(qū)地方茶樹種質(zhì)資源圃也保存大量茶樹種質(zhì)。此外，在我國(guó)廣闊的茶山林海中還有很多未被收集保存的茶樹新種質(zhì)，其中不乏一些優(yōu)異珍稀茶樹新種質(zhì)，這些資源中有許多優(yōu)異種質(zhì)未能被合理有效的利用。因此，將這些種質(zhì)資源按照親緣關(guān)系、種質(zhì)品種特性、指紋圖譜差異等進(jìn)行有效分類和鑒定，對(duì)茶樹種質(zhì)資源的研究、品種的創(chuàng)新尤為重要。目前，分子生物技術(shù)的快速發(fā)展，DNA分子標(biāo)記技術(shù)日漸成熟，已廣泛用于于多種農(nóng)作物。

DNA分子標(biāo)記以決定生物遺傳特性的基因組DNA為研究對(duì)象，一定程度代表生物的遺傳特性，且種質(zhì)的性狀變化與其息息相關(guān)。DNA分子標(biāo)記技術(shù)具有、準(zhǔn)確、穩(wěn)定性強(qiáng)、多態(tài)性高、好等優(yōu)勢(shì)，能滿足品種快速準(zhǔn)確鑒定和標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜構(gòu)建的要求。目前，DNA分子標(biāo)記技術(shù)已廣泛用于生物體的遺傳多樣性分析、DNA指紋圖譜構(gòu)建、親緣關(guān)系鑒定、品種鑒定、新品種選育等方面。而DNA指紋圖譜技術(shù)能反映核苷酸序列的差異，檢測(cè)出個(gè)體間的差異，鑒定特定的基因型，能夠迅速、準(zhǔn)確地鑒別不同的種質(zhì)，應(yīng)用較廣泛。

DNA指紋圖譜是指DNA樣品用特定分子標(biāo)記技術(shù)處理顯示出具有特定DNA片段的總稱。DNA指紋圖譜技術(shù)最早用于在刑偵或親子鑒定上確定人的身份，而后隨著生物技術(shù)的進(jìn)步與發(fā)展，DNA指紋圖譜技術(shù)在很多植物上得到廣泛的應(yīng)用。目前，常用于構(gòu)建DNA?指紋圖譜的分子標(biāo)記有SSR、AFLP、SRAP、SCoT、RAPD、SNP以及ISSR。不同分子標(biāo)記構(gòu)建的DNA指紋圖譜各有其特點(diǎn)。其中，以ISSR、SSR、SRAP應(yīng)用最廣泛，RAPD作為早期分子標(biāo)記，也有一定的應(yīng)用。SNP、SCoT標(biāo)記作為第三代分子標(biāo)記，目前應(yīng)用不廣泛，技術(shù)不夠成熟，且與其他2種標(biāo)記相比，技術(shù)難度較高，以該技術(shù)為主構(gòu)建DNA指紋圖譜的應(yīng)用較少。而SRAP分子標(biāo)記，實(shí)驗(yàn)時(shí)間較長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)操作較為繁瑣，且所用試劑毒副作用較大，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員影響較大。ISSR是當(dāng)前能夠用于大批量種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析和DNA指紋圖譜構(gòu)建最理想的一種分子標(biāo)記。應(yīng)用ISSR分子標(biāo)記構(gòu)建DNA指紋圖譜，在不同植物上都能取得很好的效果。具有引物用量少、特征標(biāo)記多、有效信息量大的優(yōu)點(diǎn)。

目前，?DNA指紋圖譜的在茶樹上的研究不多，以ISSR分子標(biāo)記技術(shù)和二維碼技術(shù)構(gòu)建茶樹DNA指紋圖譜的研究未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明在于提供一種構(gòu)建茶樹DNA指紋圖譜的方法，通過(guò)該方法構(gòu)建茶樹DNA指紋圖譜以二維碼圖形的形式體現(xiàn)，具有信息容量大、直觀、簡(jiǎn)潔、應(yīng)用性廣的特點(diǎn)。

本發(fā)明采用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)和二維碼技術(shù)構(gòu)建茶樹DNA指紋圖譜，將指紋圖譜信息通過(guò)二維碼技術(shù)處理，轉(zhuǎn)化成二維碼圖形。

具體實(shí)施如下：

采用改良CTAB法提取供試茶樹品種的總DNA，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其濃度和純度，并將DNA樣本稀釋至100?ng/uL，利用優(yōu)化后的ISSR反應(yīng)體系和篩選的引物對(duì)茶樹DNA樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，分離ISSR分子標(biāo)記，拍攝電泳圖片。根據(jù)ISSR圖譜條帶的有無(wú)，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，將電泳圖譜轉(zhuǎn)換成“0-1”形式的原始字符串。利用二維碼技術(shù)處理原始字符串，通過(guò)在一個(gè)矩形空間通過(guò)黑、白像素在矩陣中的不同分布進(jìn)行編碼，將原始字符串轉(zhuǎn)化成為二維碼圖形。

所述對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，是根據(jù)ISSR圖譜條帶的有無(wú)，利用人工方法統(tǒng)計(jì)讀帶，將電泳圖上穩(wěn)定出現(xiàn)的條帶，無(wú)論強(qiáng)弱均賦值為“1”，同一位置無(wú)條帶賦值為“0”，?輸入讀帶數(shù)據(jù)，建立原始字符串。

優(yōu)化后的ISSR反應(yīng)體系為：在20μL體系中，Ex-Buffer用1×Ex-Buffer，1U/μL?Ex-Taq酶，0.2mM/μL?dNTPs，0.5mM/μL?ISSR引物，2ng/μL?DNA模板。篩選的引物如SEQ?ID?NO.1-12所示。

構(gòu)建的茶樹DNA指紋圖譜可通過(guò)圖象輸入設(shè)備或光電掃描設(shè)備自動(dòng)識(shí)讀以實(shí)現(xiàn)信息自動(dòng)處理，通過(guò)掃描二維碼圖形便可知該茶樹品種的指紋信息，從而鑒別不同的茶樹品種。