[發(fā)明專利]用于檢測樹鼩副粘病毒的PCR試劑盒及其專用引物

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201510086952.4
• 申請日: 2015-02-25
• 公開（公告）號: CN104611472A
• 公開（公告）日: 2015-05-13
• 發(fā)明（設計）人: 賀爭鳴;王淑菁
• 申請（專利權）人: 中國食品藥品檢定研究院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 北京尚誠知識產權代理有限公司 11322
• 代理人: 魯兵

1.用于樹鼩副粘病毒PCR檢測的引物，是以樹鼩副粘病毒血凝素基因組序列自5’端第8231-8720bp區(qū)域(序列表中SEQ?ID?NO：1)為對象設計的，用以檢測樣本中是否存在樹鼩副粘病毒污染，所述引物的上游引物453-F2具有序列表中SEQ?ID?NO：2所示的核苷酸序列，下游引物453-R2具有序列表中SEQ?ID?NO：3所示的核苷酸序列。

2.用于檢測樹鼩副粘病毒的PCR試劑盒，包括權利要求1所述用于對樹鼩副粘病毒進行PCR檢測的引物。

3.根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒包括逆轉錄反應試劑和PCR反應試劑：

25μl逆轉錄反應試劑包括：5×buffer(Promega?AMV?Transcriptase，catalog#M5108)5μl，dNTP(濃度2.5mM)4μl，隨機引物(濃度500ug/mL)0.5μl，AMV(濃度10U/ul)0.5μl，去Rnase的dH₂O?7μl；

25μl?PCR反應試劑包括：HS?Taq酶(濃度5u/μl)0.15μl，10×buffer(TaKaRa?Taq^TM?Hot?Start?Version?DR007A)2.5μl，dNTP(濃度2.5mM)2μl，ddH₂O?17.35μl，上游引物453-F2(濃度10μM)1μl，下游引物453-R2(濃度10μM)1μl。

4.根據權利要求2或3所述的試劑盒，其特征在于：為方便檢測，所述試劑盒中還可包括陽性對照和陰性對照，所述陽性對照為樹鼩副粘病毒陽性質粒，所述陰性對照為不含DNA的PCR擴增體系，如雙蒸水。

5.權利要求1所述PCR引物和權利要求2-4任一所述試劑盒在樹鼩副粘病毒PCR檢測中的應用。

6.根據權利要求5所述的應用，其特征在于：所述樹鼩副粘病毒的PCR檢測方法，包括以下步驟：

1)提取樣本RNA；

2)以樣本RNA為模板逆轉錄合成其cDNA；

3)PCR檢測：以步驟2)獲得的cDNA為模板，在上述專用引物的引導下進行PCR擴增，反應結束后對PCR擴增產物進行1.5％瓊脂糖凝膠電泳，若能擴增出長度為453bp的目的片段，則檢測結果為陽性，反之為陰性。

7.根據權利要求6所述的應用，其特征在于：所述步驟1)的樣本是從樹鼩身上分離得到的血液、糞便或腎組織。

8.根據權利要求6所述的應用，其特征在于：所述步驟2)中是在合適的反應體系中，通過逆轉錄酶的催化，以樣本RNA為模板合成其DNA(cDNA)的過程，所述25μl逆轉錄反應體系為：樣本RNA(濃度0.25ug/ul)8μl，5×buffer(Promega?AMV?Transcriptase，catalog#M5108)5μl，dNTP(濃度2.5mM)4μl，隨機引物(濃度500ug/mL)0.5μl，AMV(濃度10U/ul)0.5μl，去Rnase的dH₂O?7μl；所述逆轉錄反應條件為：37℃90min，72℃15min，4℃5min。

9.根據權利要求6所述的應用，其特征在于：所述步驟3)是以樣本RNA的逆轉錄產物為模板，在合適的反應體系中，用本發(fā)明的特異性引物與cDNA相應位置互補結合，經過DNA的變性(基因組雙鏈解成單鏈)、退火(引物與模板結合)、延伸(從引物3’端合成新鏈)3個階段的循環(huán)重復，目的片段被放大，再通過瓊脂糖凝膠電泳進行樹鼩副粘病毒的定性檢測；所述25μl?PCR反應體系包括：cDNA(濃度50ng/μl)1μl，HS?Taq酶(濃度5u/μl)0.15μl，10×buffer(TaKaRa?Taq^TM?Hot?Start?Version?DR007A)2.5μl，dNTP(濃度2.5mM)2μl，ddH₂O?17.35μl，上游引物453-F2(濃度10μM)1μl，下游引物453-R2(濃度10μM)1μl；所述PCR反應條件為：先94℃5min；然后94℃1min，48℃1min，72℃1min，共35個循環(huán)；最后72℃10min。

10.根據權利要求6-9任一所述的應用，其特征在于：所述步驟3)PCR反應體系中還包括陽性對照和陰性對照，所述陽性對照為樹鼩副粘病毒陽性質粒，所述陰性對照為不含DNA的PCR擴增體系，如雙蒸水。