[發明專利]一種耐高溫耐有機溶劑的超氧化物歧化酶SOD19及其編碼基因和應用

在審

• 申請號: 201510083717.1
• 申請日: 2015-02-13
• 公開（公告）號: CN104651327A
• 公開（公告）日: 2015-05-27
• 發明（設計）人: 胡云峰;鄧盾;張云;孫愛君;梁甲元
• 申請（專利權）人: 中國科學院南海海洋研究所
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N15/53;C12N15/70;C12N1/21;A61P35/00;A61K8/66;A61Q19/08;A23L1/30;C12R1/19
• 代理公司: 廣州科粵專利商標代理有限公司 44001
• 代理人: 朱聰聰;劉明星

技術領域：

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種克隆自深海細菌枯草芽孢桿菌(Bacillus?sp.SCSIO?15121)的耐高溫耐有機溶劑的超氧化物歧化酶SOD19及其編碼基因和應用。

背景技術：

超氧化物歧化酶(superoxide?dismutase，SOD，EC?1.15.1.1)主要生理作用是清除體內氧自由基，氧自由基在生物體內的過度積累會導致衰老、細胞凋亡等過程，因而，SOD酶被廣泛應用在生物醫藥、化妝品、食品和農業等領域。例如，研究表明服用SOD藥物能夠預防和治療癌癥，SOD藥物對于食道癌、直腸癌和乳腺癌等均有較好療效，因此，SOD在生物醫療領域有著巨大的應用價值。

再如，在化妝品中添加SOD的主要作用是利用SOD來清除自由基，人們在長期的強光、缺氧等環境下能產生對皮膚造成損害的活性氧。活性氧不能及時清除會導致衰老，衰老過程和SOD表達量的減少密切相關。另外，皮膚中的SOD表達量也會隨著年齡的增長而減少，SOD可以通過皮膚吸收并解決諸多皮膚問題，因此SOD深受女性的喜愛。

另外，SOD在食品中也有較大的應用價值，一些SOD通過口服也是有效的，因此通過食物補充SOD也是可行的。SOD酸奶、SOD啤酒、水果和大米等食品不斷被開發。

隨著SOD應用范圍的擴大，SOD的需求越來越大。開發高品質的SOD酶，尤其是熱溫度的SOD，就顯得十分迫切。比如食品加工過程大多涉及到加熱提取，滅菌等過程，常溫SOD酶很難滿足應用。現階段SOD的來源主要有：第一，從動物或其組織中直接提取；第二，從微生物或其它生物中提取；第三，利用生物工程的方法發酵獲得。第一種方法獲得的SOD存在艾滋病等血液病毒交叉感染的潛在危險，第二種方法受原材料制約，只有第三種方法技術簡單、效率高、成本低，符合工業生產的需要。

超氧化物歧化酶是一類金屬酶，需要結合金屬離子才能催化清除氧自由基的過程，根據金屬離子輔基的不同，可以將SOD分為三大類：Cu/Zn?SOD，Fe或Mn-SOD以及Ni-SOD。SOD酶穩定性和酶活較高的多集中在SODA家族的Fe和Mn-SOD。

發明內容：

本發明的第一個目的是提供一種耐高溫耐有機溶劑的超氧化物歧化酶SOD19及其編碼基因。

本發明的耐高溫耐有機溶劑的超氧化物歧化酶SOD19，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ?ID?No.2所示。

本發明的編碼耐高溫耐有機溶劑的超氧化物歧化酶SOD19的基因，其特征在于，編碼氨基酸序列如SEQ?ID?No.2所示的耐高溫耐有機溶劑的超氧化物歧化酶SOD19。

所述的編碼耐高溫耐有機溶劑的超氧化物歧化酶SOD19的基因，優選，其核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示。

本發明的第二個目的是提供核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示的基因在編碼耐高溫耐有機溶劑的超氧化物歧化酶SOD19中的應用。

本發明的第二個目的是提供一種表達載體，其特征在于，含有上述編碼耐高溫耐有機溶劑的超氧化物歧化酶SOD19的基因。

本發明的第三個目的是提供一種含有上述表達載體的微生物。

本發明的第四個目的是提供耐高溫耐有機溶劑的超氧化物歧化酶SOD19的誘導表達方法，其特征在于，包括以下步驟：

將轉有編碼耐高溫耐有機溶劑的超氧化物歧化酶SOD19基因的微生物在培養基中培養至OD600為0.5-0.6，加IPTG至濃度為0.2mM，再加MnCl₂至濃度為0.1mM，18℃培養16個小時，即可高效誘導表達耐高溫耐有機溶劑的超氧化物歧化酶SOD19。

本發明的第五個目的是提供耐高溫耐有機溶劑的超氧化物歧化酶SOD19在制備生物醫藥、化妝品和食品中的應用。

本發明的耐高溫耐有機溶劑的超氧化物歧化酶基因sod19來自深海樣品中篩選得到的一株枯草芽孢桿菌(Bacillus?sp.SCSIO15121)。本發明對枯草芽孢桿菌(Bacillus?sp.SCSIO15121)進行基因組測序和生物信息學分析，確定了超氧化物歧化酶基因sod19邊界，并設計引物，在引物5’端加上保護堿基和酶切位點，其中上游引物加入EcoRI位點，下游加入XhoI酶切位點。提取純化提取枯草芽孢桿菌(Bacillus?sp.SCSIO15121)的總DNA，使用高保真的DNA聚合酶pfu進行PCR擴增，獲得超氧化物歧化酶基因sod19，其核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示，從起始密碼子到終止密碼子全長為609p，編碼202個氨基酸。