[發明專利]一種熱帶假絲酵母DK2菌株制備漆酶的方法

有效

• 申請號: 201510080795.6
• 申請日: 2015-02-15
• 公開（公告）號: CN104726425B
• 公開（公告）日: 2018-08-03
• 發明（設計）人: 丁若垚;郁崇文;張興群;原月夢;孔德枝;常慧
• 申請（專利權）人: 東華大學
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12R1/74
• 代理公司: 上海泰能知識產權代理事務所 31233
• 代理人: 黃志達

本發明涉及一種熱帶假絲酵母DK2菌株制備漆酶的方法，包括：(1)將熱帶假絲酵母DK2菌株由PDA斜面培養基轉接入裝有基礎液體培養基的三角瓶中，震蕩培養，發酵液經過濾得到菌絲體，菌絲體用無菌水洗凈打散，隨后收集于無菌水中制成菌絲懸浮液，保存備用；(2)在三角瓶中裝入產酶培養基，接入上述菌絲懸浮液，震蕩培養，培養過程中定時提取發酵液，離心后取上清液即為粗酶液；(3)將上述粗酶液離心，取上清液即得漆酶。本發明具有工藝簡單、適合大規模工業化生產等特點，制備的漆酶可以有效去除亞麻、黃麻、紅麻或竹纖維中的非纖維素膠質，具有脫膠效率高，脫膠周期短，纖維分散率高，精干麻質量好等優點，具有良好的應用前景。

技術領域

本發明屬于生物紡織技術領域，特別涉及一種熱帶假絲酵母DK2菌株制備漆酶的方法。

背景技術

漆酶(Laccase，EC.1.10.3.2)是一種含銅的多酚氧化酶，與植物中的抗壞血酸氧化酶、哺乳動物血漿中的銅藍蛋白同屬于銅藍氧化酶家族。真菌漆酶由于它具有較高的氧化還原電勢，作用底物范圍非常廣泛，能催化氧化多種酚和芳胺類化合物，同時將分子氧還原成水。漆酶突出的催化特性是它的底物具有廣泛性、催化反應具有復雜性，生成的產物具有環境友好性.所以，近年來利用真菌制備漆酶在麻纖維脫膠中的應用研究越來越廣泛。

麻纖維種類繁多，它們由不同比重的纖維素、半纖維素、木質素、果膠和雜質組成，紡織加工中，必須經過“脫膠”，即去除果膠、半纖維素和木質素等非纖維素物質(統稱為膠質)，才能獲得用于輕紡的纖維，實現其使用價值。麻行業常用的煮練方法主要是化學方法，即利用強酸強堿對原麻或粗紗進行處理，化學脫膠工藝耗能大，設備損耗大，且排放的廢水無法循環利用，污染問題嚴重。酶法脫膠就是將脫膠菌培養到菌生長的衰老期后進行過濾或離心等處理，再用得到的粗酶液浸漬原麻。粗酶液可以將麻纖維中的果膠、半纖維素、木質素等物質分解轉化為簡單的低分子物質，從而完成麻纖維的脫膠過程。也可將粗酶液提純，濃縮為液劑，或者將該濃縮液干燥成為粉劑。使用時將液劑稀釋或將粉劑溶于水，把原麻浸漬在酶稀釋液中進行酶解脫膠。酶法脫膠工藝無需專用設備，快速高效，無污染，生產的精干麻質量好。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種熱帶假絲酵母DK2菌株制備漆酶的方法，該方法具有工藝簡單、適合大規模工業化生產等特點，制備的漆酶活性高、用量少且酶活穩定。

本發明的一種熱帶假絲酵母DK2菌株制備漆酶的方法，包括：

(1)將熱帶假絲酵母DK2菌株由PDA斜面培養基轉接入裝有基礎液體培養基的三角瓶中，在搖床中30～40℃恒溫震蕩培養3～4d后，發酵液經過濾得到菌絲體，菌絲體用無菌水洗凈打散，隨后收集于無菌水中制成菌絲懸浮液，保存備用；

(2)在基礎液體培養基中分別加入1～2％w/v的天然底物和不同濃度的CuSO₄·5H₂O作為產酶培養基，在三角瓶中裝入產酶培養基，接入上述菌絲懸浮液，在搖床中30～40℃恒溫震蕩培養，培養過程中定時提取發酵液，離心后取上清液即為粗酶液；

(3)將上述粗酶液于4～6℃離心，取上清液即得漆酶。

所述步驟(1)中的熱帶假絲酵母DK2菌株的ITS序列如SEQ ID NO:1所示。

根據ITS測序Blast及聚類分析結果，該菌與熱帶假絲酵母菌相似性為99％，結合生理生化試驗結果和鏡檢分析，命名此菌株為熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)DK2菌株。ITS測序中，所采用的正向引物為：ITS1(5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)、反向引物為ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)，均為國際通用引物，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。