[發明專利]一種用于檢測食品中細菌的探針、試劑盒和方法無效

申請號：	201510080114.6	申請日：	2015-02-13
公開（公告）號：	CN104651512A	公開（公告）日：	2015-05-27
發明（設計）人：	方國偉;洪冉;劉振世;易春	申請（專利權）人：	蘇州達麥迪生物醫學科技有限公司
主分類號：	C12Q1/68	分類號：	C12Q1/68;C12Q1/10;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/19
代理公司：	廣州三環專利代理有限公司 44202	代理人：	郝傳鑫
地址：	215163 江蘇省蘇州市高***	國省代碼：	江蘇;32
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摘要：
搜索關鍵詞：	一種用于檢測食品細菌探針試劑盒方法
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【說明書】：

技術領域

本發明涉及一種檢測用的探針，具體涉及一種用于檢測食品中細菌的探針、試劑盒和方法。

背景技術

食品細菌即指常在食品中存在的細菌，自然界的細菌種類繁多，但由于食品理化性質，所處環境條件及加工處理等因素的限制，在食品中存在的細菌只是自然界細菌的一小部分。食品細菌包括致病菌和非致病菌：致病菌是指隨食物進入人體后可引起食源性疾病，常見者如沙門氏菌、志賀氏菌等，與疾病直接有關，一般規定在食品中不允許檢出。非致病菌一般不引起人類疾病，但其中一部分為腐敗菌，如假單胞菌，與食品變質有密切關系，是評價食品衛生質量的重要指標。

在我國的食品衛生標準中，測定食品中細菌數量的方法，是在嚴格規定的培養方法和培養條件下進行的，使得適應這些條件的每一個活菌細胞能夠生成一個肉眼可見的菌落，所生成的菌落總數即是該食品中的細菌總數。食品中細菌的種類很多，它們的生理特性和所需要的培養條件不盡相同。如果要采用培養的方法計數食品中所有的細菌種類和數量，必須采用不同的培養基及培養條件，其工作量很大，通常會采用檢測指標菌的方法來替代。

例如，腸道致病菌如沙門氏菌屬和志賀氏菌屬是引起食物中毒的重要致病菌，然而這些致病菌往往數量較少且難以培養，對食品進行逐批逐件地檢驗又不可能，鑒于大腸菌群與腸道致病菌來源相同，而且一般在外環境中生存時間也與主要腸道病原菌一致，所以大腸菌群通常就作為腸道病原菌污染食品的指示菌。通過檢測指標菌來大致判斷食品中的致病菌存在狀況，不失為一種簡便方法，但很顯然，指標菌和病原菌的存在并非完成平行的關系——食品中檢出大腸菌群，只能說明有腸道病原菌存在的可能性，食品中未檢測大腸菌群，也不能完全排除食品中可能有腸道病原體污染。

由此可見，當前的食品細菌檢測方法并不能很好地滿足簡便、快速、準確的檢測需求，對于難培養、難鑒定的食品源致病菌，需要更高效的檢測手段。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術存在的不足之處而提供了一種探針，所述探針能用于檢測食品中細菌，通過熒光原位雜交的手段，本發明還提供了一種快速、靈敏、特異性地檢測食物中常見細菌的試劑盒和方法。

為實現上述目的，所采取的技術方案：一種用于檢測食品中細菌的探針，所述探針呈分子信標結構，即探針序列由莖、環兩部分組成，總長度25～60個堿基，其中中間的環序列部分與細菌16s?rRNA或23s?rRNA序列相匹配，兩端莖部分是5～8個互補的DNA或PNA序列，探針在常溫下會自動退火形成發夾結構；探針的5’端用熒光基團標記，3’端用熒光淬滅基團標記，常態下游離的探針由于呈發夾結構，熒光基團因緊挨熒光淬滅基團，而不會有熒光發出，只有當探針與靶序列成功雜交上之后，熒光基團和熒光淬滅基團分離開來，才會發出熒光；

所述探針是通過核酸雜交的原理檢測食品中的細菌的，所述細菌包括食品中正常攜帶的細菌以及食品被污染后帶上的致病菌。

優選地，所述探針5’端的熒光基團為FITC、FAM和Cy3中的一種，所述探針3’端的熒光淬滅基團為DABCYL、BDH和TANRA中的一種。

本發明提供了一種用于檢測食品中細菌的試劑盒，所述試劑盒包括：

(1)上述所述的探針；

(2)重懸固定液；

(3)雜交液；

(4)洗滌液；

所述重懸固定液包括：

優選地，所述雜交液包括5％(w/v)PEG，50mM?NaCl，40％(v/v)甲酰胺，0.5％(w/v)過硫酸銨，1％(w/v)DEPC，1％(w/v)聚蔗糖，50mM?EDTA，0.1％(v/v)TritonX-100，50mM?pH?8.0的Tris-HCl；

所述洗滌液包括50mM?Tris-HCl(pH?10.0)，0.5M?NaCl，0.1％(v/v)NP-40，0.5％(v/v)Triton?X-100。

本發明還提供了一種用于檢測食品中細菌的方法，所述方法采用上述所述試劑盒來檢測，所述方法包括以下步驟：

(1a)取待檢食品樣品，加入到重懸固定液中，震蕩混勻；