[發明專利]一種自然殺傷細胞擴增的方法和一種培養基組合物

有效

• 申請號: 201510080080.0
• 申請日: 2015-02-13
• 公開（公告）號: CN104673750B
• 公開（公告）日: 2018-04-27
• 發明（設計）人: 張強;張榮勝;李程;項春生
• 申請（專利權）人: 杭州易文賽生物技術有限公司
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783
• 代理公司: 北京英創嘉友知識產權代理事務所(普通合伙)11447
• 代理人: 王浩然,周建秋

技術領域

本發明涉及生物醫藥技術領域，具體地，涉及一種自然殺傷細胞擴增的方法和一種培養基組合物。

背景技術

自然殺傷細胞(Natural killer cell，NK細胞)是機體抵抗惡性腫瘤和病毒感染的重要免疫調節細胞。NK細胞可以分泌穿孔素、NK細胞毒因子(NK cytotoxic factor,NKCF)和腫瘤壞死因子(TNF)。其中，穿孔素是一種由NK細胞胞漿顆粒釋放的殺傷靶細胞的介質。從NK細胞胞漿顆粒中純化的穿孔素在體外能溶解多種腫瘤細胞，抗穿孔素抗體可抑制殺傷活性。IL-2可提高穿孔素基因的轉錄。IL-6可以促進IL-2對穿孔素基因轉錄的誘導作用。絲氨酸酯酶可能有活化穿孔素的作用。其中，NKCF與靶細胞結合后可選擇性殺傷和裂解靶細胞。其中，TNF通過改變靶細胞溶酶體的穩定性，導致多種水解酶外漏，還能影響細胞膜磷脂代謝，還能改變靶細胞糖代謝使組織中pH降低，還能活化靶細胞核酸內切酶，降解基因組DNA從而引起程序性細胞死亡等機理殺傷靶細胞；TNF引起細胞死亡過程要明顯慢于穿孔素溶解細胞的作用過程。

NK細胞確切的來源還不十分清楚，一般認為直接從骨髓中衍生，其發育成熟依賴于骨髓的微環境。小鼠和人的體外實驗表明，胸腺細胞在體外IL-2等細胞因子存在條件下培養也可誘導出NK細胞。小鼠脾臟在體內IL-3誘導下可促進NK細胞的分化。NK細胞主要分布于外周血中，占外周血單個核細胞的5-10％，淋巴結和骨髓中也有NK細胞，但水平較外周血低。

擴增自然殺傷細胞能夠使得針對自然殺傷細胞的研究更加方便，并有利于獲得穿孔素、NK細胞毒因子和腫瘤壞死因子。目前對自然殺傷細胞擴增的方法包括抗體篩選自然殺傷細胞，聯合各種有效的細胞因子相互組合擴增自然殺傷細胞以及通過表達細胞因子的飼養細胞共培養等。但這些方法在培養過程中對細胞培養人員的操作水平要求高，擴增、培養成本昂貴，培養體系不穩定，培養時需要培養擴增出的具有細胞毒作用的CD3^-CD56⁺效應細胞數占比低。

CN102154207A公開了利用CD8-IL21-CD137復合方法擴增激活淋巴細胞(包括NK細胞)的方法，該方法包括：在含有所述淋巴細胞的培養液中，將表達CD8-IL21-CD137復合物的宿主細胞以及白介素2共同培養7天。CN102428173A公開了一種NK細胞培養的方法，該方法包括：利用滅活的K562腫瘤細胞飼養NK細胞以提高NK細胞的殺傷能力。CN103232973A公開一種通過K562腫瘤細胞作為飼養細胞培養NK細胞的方法，其中，K562腫瘤細胞含CD8α、IL21、CD14、CD19、CD86和CD137的表達載體。

因此，現有的對自然殺傷細胞擴增的方法需要與飼養其它細胞的共培養，并且需要發費較長時間通過分子克隆手段構建飼養細胞或細胞因子表達體系，培養成本高，擴增步驟繁瑣，難以符合GMP標準，可重復性及穩定性差。

發明內容

本發明的目的是克服現有的對自然殺傷細胞擴增的方法需要與其它細胞的共培養的缺陷，提供一種單獨培養且擴增效率較高的自然殺傷細胞擴增的方法。

本發明的發明人出乎意料地發現使用添加了特定細胞因子和特定抗體的培養基對自然殺傷細胞進行擴增，能夠在單獨培養的條件下取得較高的自然殺傷細胞的擴增效率，由此得到了本發明。

為了實現上述目的，本發明提供一種自然殺傷細胞擴增的方法，該方法包括如下步驟：(1)從全血中分離淋巴細胞，并將淋巴細胞接種在第一培養基中進行第一擴增培養，得到第一擴增培養產物；(2)將所述第一擴增培養產物與第二培養基按1：(0.5-2)的體積比混合并進行第二擴增培養，得到第二擴增培養產物；(3)將所述第二擴增培養產物替代第一擴增培養產物返回步驟(2)的操作并循環進行步驟(2)的操作2-7次；其中，所述第一培養基含有基礎培養基和5-30mg/mL的L-谷氨酰胺、50-400IU/mL的硫酸慶大霉素、2-20μg/mL的甘露聚糖肽、300-1600IU/mL的白介素2、5-40ng/mL的抗人CD16單抗和5-60ng/mL的白介素15；所述第二培養基含有5-30mg/mL的L-谷氨酰胺、50-400IU/mL的硫酸慶大霉素、2-20μg/mL的甘露聚糖肽、300-1600IU/mL的白介素2、和5-60ng/mL的白介素15。