[發明專利]一種提高鼠李糖脂產量的基因工程方法及其專用菌株

在審

• 申請號: 201510078536.X
• 申請日: 2015-02-13
• 公開（公告）號: CN104762313A
• 公開（公告）日: 2015-07-08
• 發明（設計）人: 朱坤;胡明杰;于海英
• 申請（專利權）人: 中國科學院微生物研究所
• 主分類號: C12N15/78
• 分類號: C12N15/78;C12N15/55;C12N1/21;C12R1/385
• 代理公司: 北京輕創知識產權代理有限公司 11212
• 代理人: 楊立

技術領域

本發明屬于生物技術領域，尤其涉及一種提高鼠李糖脂產量的基因工程方法及其專用菌株。

背景技術

鼠李糖脂是由假單胞菌或伯克氏菌類產生的一種糖脂類生物表面活性劑。根據鼠李糖脂的化學結構可以分為單鼠李糖脂和雙鼠李糖脂，其親水基團一般由1-2分子的鼠李糖環構成，疏水基團則由1-2分子具有不同碳鏈長度的飽和或不飽和脂肪酸構成。在合成過程中，這些基團之間可能相互連接而生成多種化學結構相近的同系物。到目前為止已經鑒定了假單胞菌屬和伯克氏菌屬的60多種鼠李糖脂，最常見的由銅綠假單胞菌產生的鼠李糖脂為雙糖雙脂(Rha-Rha-C10-C10)和雙糖單脂(Rha-Rha-C10)。

鼠李糖脂作為一種生物表面活性劑，不僅溶于甲醇、氯仿和乙醚，在堿性水溶液中也表現出良好的溶解特性，并兼具無毒和生物降解的特性。鼠李糖脂可以降低水表面張力，可以作為潤濕劑、乳化劑和發泡劑使用，而且它可以在溫度、PH值及鹽度處于極端狀況下使用。因此，鼠李糖脂應用于石油工業、綠色農業、環境治理、醫藥、食品加工、化妝品等行業。

目前，鼠李糖脂的生產菌株主要是銅綠假單胞菌，其生產性能的提高一般是通過各種理化誘變技術和基因改造手段提高菌株鼠李糖脂的生產能力。理化誘變能夠篩選到高產鼠李糖脂菌株，但是極易回復突變，造成菌株生產性能的不穩定。基因改造手段能夠定向的對菌株進行改造，但因為鼠李糖脂?的合成的代謝途徑復雜，需要改造合適的基因才能提高鼠李糖脂的產量。

銅綠假單胞菌中鼠李糖脂的合成包括三個連續的反應：首先由RhlA催化形成β-羥基脂肪酸，然后由鼠李糖基轉移酶ⅠRhlB催化和dTDP-L-鼠李糖反應生成單鼠李糖脂，最后由鼠李糖基轉移酶ⅡRhlC以單鼠李糖脂和dTDP-L-鼠李糖反應生成雙鼠李糖脂。dTDP-L-鼠李糖前體為鼠李糖脂的親水部分，由D-葡萄糖-6-磷酸在葡萄糖磷酸變位酶AlgC和RmlDBAC的作用下合成。脂質疏水部分的脂肪酸一部分來自于脂肪酸降解β-氧化途徑的中間產物，另一部分則由類型II的脂肪酸合成酶(FAS?II)催化從新合成的。

目前，對于酶PA3286(由pa3286基因編碼)的研究大多是認為與脂肪酸代謝途徑有關，但pa3286對于鼠李糖脂產量的影響并未有相關文獻報道。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種提高鼠李糖脂產量的基因工程方法，并提供利用所述方法制備的鼠李糖脂生產菌。

本發明通過在鼠李糖脂生產菌中對pa3286基因的過表達實現的。pa3286基因，并不參與鼠李糖脂的生物合成途徑，但是當在載體上克隆該基因并在細菌中表達時，可以提高所述細菌中鼠李糖脂產量，此外以其他形式，如在染色體上過表達所述基因或者調控所述基因的表達調控序列也可以使所述細菌中鼠李糖脂產量明顯提高。

本發明解決上述技術問題的技術方案如下：

一種提高鼠李糖脂產量的基因工程方法，包括以下步驟：

1)構建pa3286基因編碼的蛋白表達量增加的鼠李糖脂生產菌，所述pa3286基因具有如SEQ?ID?NO：1中35-1087所示的核酸序列；

2)在培養基中培養步驟1)構建的鼠李糖脂生產菌；

3)提取步驟2)培養基中的鼠李糖脂，并檢測鼠李糖脂的產量。

本發明所述的蛋白表達量增加指蛋白濃度的增加和/或蛋白活性增加。

所述pa3286基因具有如SEQ?ID?NO：1所示的核酸序列或者含有對序列表SEQ?ID?NO:1中核酸序列缺失、替換、插入或添加一個或多個堿基后所得到的序列，所述得到的核酸序列與原序列相比仍然具有同樣的功能或者活性增加。

所述pa3286基因編碼的蛋白具有如SEQ?ID?NO：2所示的氨基酸序列或者含有對序列表SEQ?ID?NO:2中氨基酸序列缺失、替換、插入或添加一個或多個氨基酸后所得到的氨基酸序列，所述得到的序列與原序列仍然具有同樣的功能或者活性增加。

所述構建pa3286基因編碼的蛋白表達量增加的鼠李糖脂生產菌的方法，可以將上述pa3286基因克隆到多拷貝載體上再轉入鼠李糖脂生產菌中，也可以將pa3286基因整合到染色體上，或者對pa3286基因的表達調控序列進行改造使其蛋白表達量增加。