[發明專利]一種用于檢測LEPR基因127bpdeletion可變剪接體的引物、試劑盒及檢測方法

有效

• 申請號: 201510077400.7
• 申請日: 2015-02-13
• 公開（公告）號: CN104673910B
• 公開（公告）日: 2017-12-01
• 發明（設計）人: 劉小軍;王丹丹;王臺安;蔣瑞瑞;徐春林;李轉見;田亞東;康相濤
• 申請（專利權）人: 河南農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 鄭州天陽專利事務所(普通合伙)41113
• 代理人: 聶孟民

技術領域

本發明涉及生物技術領域，特別是一種用于檢測LEPR基因127bp deletion可變剪接體的引物，以及包含該引物的試劑盒及檢測方法。

背景技術

瘦素(Leptin)主要是由非鳥類脊椎動物白色脂肪組織分泌的小肽類激素，與瘦素受體（LEPR）結合發揮其生物學功能。然而，LEPR的功能研究由于禽內源性Leptin的缺乏而受到限制。最近，鳥類Leptin基因的成功克隆將鳥類Leptin及LEPR的研究又推向了新的高潮。鳥類LEPR基因組織廣泛性表達特征已得到證明，但其多種可變剪接體的鑒別和分離進展相對緩慢，這將在一定程度上阻礙了LEPR基因生理功能的研究。因此利用分子生物手段鑒別某一剪接體組織表達模式，進而對其生物學功能的闡明具有推動作用，意義重大。

可變剪接體是影響蛋白質發揮功能的重要原因之一。LEPR是一種跨膜受體，屬于I類細胞因子受體家族，由胞外區、跨膜區及胞內區3部分組成。目前的研究將LEPR的可變剪接體分為3類，即：長型、短型和可溶型。在小鼠中已經發現6種LEPR剪接異構體（LEPR-a, b, c, d, e, f），其中包括長型（LEPR-b）、短型（LEPR-a,c,d,f）和可溶型（LEPR-e），其功能研究近年來也取得了一定的進展。然而，在鳥類尤其是禽類中僅發現兩種LEPR剪接異構體（長型和短型），而且檢測繁瑣、耗時長、準確率低，因此深入探究剪接體的生物功能是亟需解決的技術問題。

發明內容

針對上述情況，為客服現有技術之缺陷，本發明的目的就是提供一種檢測LEPR基因127bp deletion可變剪接體的引物以及包含該引物的試劑盒及檢測方法，可有效解決現有的檢測方法程序繁瑣、耗時長、準確率低的問題。

本發明解決的技術方案：在對鳥類（如鵪鶉）的LEPR基因克隆和功能研究的過程中發現在第9外顯子和第10外顯子之間有一127bp的缺失片段，這種缺失符合GT-AG剪接模式，預測蛋白序列屬于可溶型受體，據此本發明解決的技術方案是

一種用于檢測LEPR基因127bp deletion可變剪接體的引物，包括引物對P和引物對ACTB，

所述的引物對P為：

上游引物，P-F：5’- CTTGTGAACGATCGCATGTG -3’；

下游引物，P-R：5’- GTGGTATCTTAACTGCAAGG -3’；

所述的引物對ACTB為：

上游引物，ACTB-F：5’- GAGAGAAGATGACACAGAC -3’；

下游引物，ACTB-R：5’- GTCCATCACAATACCAGTGG -3’。

一種用于檢測LEPR基因127bp deletion可變剪接體的試劑盒，所述試劑盒包括引物對P、引物對ACTB、2×SYBR^?Premix Ex Taq^TM和去RNA酶的超純水。

一種檢測LEPR基因127bp deletion可變剪接體的的方法，包括以下步驟：

（1）以待測cDNA為模板，以引物對ACTB為引物，實時熒光定量PCR（簡稱qPCR，下同）擴增ACTB內參基因，以引物對P為引物，實時熒光定量PCR擴增LEPR基因127bp deletion可變剪接體，所述的熒光定量PCR擴增的反應體系包括有2×SYBR^?Premix Ex Taq^TM 9~11μL，去RNA酶的超純水7~8μL，引物P-F或ACTB-F0.5~1μL，引物P-R或ACTB-R0.5~1μL，cDNA模板0.5~1.5μL構成，其反應方法是92~96℃預變性4~6min，92~96℃變性8~12s，55~65℃退火25~35 s，70~74℃延伸25~35s，35~45個循環；

（2）對步驟（1）的qPCR實時監測結果進行擴增曲線和熔解曲線分析，采用 2^-△CT相對定量的方法計算，用SPSS version 20.0進行差異顯著性檢驗。

本發明還提供了所述的引物對P和引物對ACTB在檢測LEPR基因127bp deletion可變剪接體中的應用。

本發明還提供了所述的試劑盒在檢測LEPR基因127bp deletion可變剪接體中的應用。