[發明專利]提取基因組DNA的試劑盒和提取方法

有效

• 申請號: 201510072951.4
• 申請日: 2015-02-11
• 公開（公告）號: CN104630208B
• 公開（公告）日: 2018-01-02
• 發明（設計）人: 林源吉;丁佳女;葉俊波;洪巧娟
• 申請（專利權）人: 杭州百邁生物股份有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及分子生物學的生物樣品提取領域，尤其涉及一種提取基因組DNA的試劑盒和提取方法。

背景技術

目前常采用CTAB法、PTB法、QIAGEN試劑盒法、高鹽低pH法等方法提取基因組DNA。CTAB法采用CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化銨)，它是一種陽離子去污劑，在高離子強度的溶液中，CTAB與蛋白質和多聚糖形成復合物，產生沉淀，但卻不能與核酸形成復合物產生沉淀。通過離心獲得含有核酸的上清液，通過加入氯仿等有機試劑進行抽提，去除蛋白、多糖、酚類等雜質后，加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來。CTAB法需要用到β-巰基乙醇、氯仿、酚等試劑。但酚和氯仿的使用會對人體有一定的危害，并污染環境。且提取大概需要花費2-3天時間。PTB法需要使用EDTA、蛋白酶K、PTB、酚、氯仿等試劑，其操作步驟異常繁瑣，操作時間需5-7天，操作過程中會使用到酚、氯仿多種有害物質。高鹽低pH法：需要使用EDTA、NaCl、醋酸鈉、十二烷基硫酸鈉(SDS)、氯仿、醋酸鉀等試劑。操作步驟與CTAB法類似，但是提取的DNA得率較低且雜質較多。試劑盒法：使用方便但是提取的得率較低，在樣品本身DNA含量低的情況下具有明顯的局限性，并且成本較高。以上這些提取方法和方法本身的不足在很多文獻中有報道。

在人們的生產、生活中，木材的保護和合理利用成為人們所關注的焦點。隨著時代發展和人們生活水平的不斷提高，木制材料在生活中的應用越來越受到人們的青睞，特別是一些高檔名貴木材制品也躋身于奢侈品行列，成為人們追求生活品質的象征。正是由于這些珍惜名貴木材與普通木材在價格上存在巨大的差額，導致一些不法分子將一些容易混淆和不易區分的樹種和木材制品當做名貴珍惜樹種和木材制品進行銷售，極大地擾亂了紅木市場、仿古木市場、古典家具市場和名貴樂器市場的正常秩序，在經濟上和精神上給消費者帶來了巨大的損失和打擊。而一些禁止砍伐的珍貴樹種也被喬裝成普通木材進行運輸和走私，這無疑給林業檢查和海關人員的識別工作增加了難度。因此，在木材加工、利用、使用和貿易活動中，對木材進行科學、快速、準確地識別和鑒定就顯得尤為重要和迫切。

傳統的木材識別方法要求鑒定者有豐富的植物學知識和木材構造方面的專業知識。通常以傳統的木材鑒定手段，解剖切片觀察木材的構造以及形態特征從而得出判定結果。由于鑒定者對具體形態特征的主觀感受不一樣，有時候即使是專業的人員得出的鑒定結果也不完全一致，尤其是形態特征比較相似的木材品種。隨著分子生物學技術的發展，基因組DNA分析也被運用到鑒定木材的方法中。而運用基因組DNA分析技術識別和鑒定木材的前提是從木材組織中提取到足夠數量和高質量的DNA，以滿足后續的PCR擴增、基因測序等分子生物學鑒定方法。

現有的提取方法和試劑盒通常只能用于一般的植物基因組DNA，例如葉片、莖等植物的幼嫩組織。相比鮮嫩且具有分生能力的植物組織而言，從木材組織中提取和擴增DNA要困難很多。主要原因為以下幾個方面：(1)木材組織中存在的DNA數量較少，且常常降解成小片段。(2)木材組織中存在有厚壁的管狀分子，導致在碾磨處理這些堅硬組織時會產生高溫，這進一步損傷DNA分子。(3)木材中存在一些如蛋白質、酚類、多糖、單寧和色素等物質，這些物質往往會影響DNA聚合酶的活性，干擾引物與模板結合，導致PCR擴增失敗。(4)木材受存放環境地影響，如潮濕環境下會造成木材腐朽和真菌污染，導致DNA降低和污染。目前還沒有針對植物木質部基因組DNA的提取試劑盒和提取方法。在木材交易中，木材的莖葉往往都已經摘除。成品家具自然更不會有莖葉等幼嫩組織，且通常都經過熏、蒸、擠壓等加工。因此現有植物的DNA提取方法并不適合木材和家具的DNA提取。另一方面，木材和家具交易是一個快速的交易過程。在木材和家具的進出口過程中，也需要在短時間內完成木材的鑒定。而現有的植物DNA提取方法通常需要至少2天以上，有的甚至要一周的時間。因此現有的提取方法不能滿足快速鑒定木材基因組DNA的要求。現有的提取試劑和方法也不能提取出微量樣本中DNA，例如采用現有的提取試劑和提取方法提取利用微創方法采集到的樣本中的DNA，其產物得率很差。

發明內容