[發明專利]一種鴨的TLR3基因的熒光定量PCR檢測方法

有效

• 申請號: 201510067874.3
• 申請日: 2015-02-09
• 公開（公告）號: CN104651503B
• 公開（公告）日: 2017-01-11
• 發明（設計）人: 劉光清;宋凱杰;陳宗艷;李傳峰;孟春春
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院上海獸醫研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/63;C12N15/11
• 代理公司: 上海漢聲知識產權代理有限公司31236
• 代理人: 郭國中

技術領域

本發明涉及一種鴨的TLR3基因的熒光定量PCR檢測方法，屬生命科學領域。

背景技術

Toll樣受體(Toll-like?receptors,TLRs)是一類進化上保守的Ⅰ型跨膜受體，包括富含亮氨酸(Leucine?Rich?Repeats，LRRs)的胞外區、跨膜區和胞內TIR區(Toll/interleukin-1receptor)。作為先天性免疫在防御微生物感染的第一道防線，TLRs在檢測病原相關分子模式(Pathogen-associated?molecular?patterns,PAMPs)方面起重要作用，最終激活適應性免疫應答。TLR3可識別雙鏈RNA(dsRNA)，通過非MyD88依賴的信號通路途徑，結合TRIF介導下游信號轉導，激活IRF-3和核因子κB(nuclear?factor?kappa-B,NF-κB)，刺激誘導大量IFN-α/β及其他細胞因子的表達，分泌的干擾素能夠抑制病毒的復制，從而達到抗病毒功能。

相對于哺乳動物的Toll樣受體，禽類的Toll樣受體研究較為緩慢，目前關于鴨TLR3研究，Jiao等對番鴨TLR3有報道。傳統的RT-PCR是半定量方法，在檢測基因表達量方面精確度不高。Yulin?Qi等運用半定量的方法檢測鵝TLR3的組織分布，用β-actin作為對照發現法氏囊的表達量最高。Guo等建立了半定量RT-PCR方法來檢測TLRs在牛單核細胞和單核巨噬細胞中的分布和表達規律。以上方法要么檢測物種寬泛，要么檢測敏感性不高。國內尚未見有關應用熒光定量PCR技術檢測北京鴨TLR3的方法報道，并且本實驗首次從鴨外周血單核細胞中克隆了北京鴨的TLR3基因。為研究鴨的TLR3在鴨發病過程中作用及表達水平變化，急需建立一種有效的檢測方法。本實驗建立的方法具有高敏感性、高特異性，高穩定性，且相比TaqMan探針法來說，價格便宜，靈敏度也較探針法高(見附圖6)。本實驗建立的方法可應用于分子生物學和生命科學研究領域。目前將熒光定量PCR方法應用于檢測北京鴨TLR3基因的方法未見有報道。

發明內容

針對現有技術中的缺陷，本發明的目的是提供一種鴨的TLR3基因的熒光定量PCR檢測方法。

本發明是通過以下技術方案實現的：

第一方面，本發明提供一種用于鴨的TLR3基因的熒光定量PCR檢測的重組質粒pEASY-T5-zero-TLR3。

優選地，所述重組質粒的標準品的純度：OD_260/280值為1.8～2.0；低于該1.8說明標準品有蛋白污染，高于2.0說明存在DNA存在降解現象。

優選地，所述重組質粒pEASY-T5-zero-TLR3的構建是將TLR3基因PCR擴增產物克隆于pEASY-T5-Zero載體中實現的。

第二方面，本發明提供一種用于鴨的TLR3基因的熒光定量PCR檢測的引物，所述引物的序列如SEQ?ID?No.3、SEQ?ID?No.4所示。

SEQ?ID?No.3引物大小為20bp，結合于鴨TLR3開放閱讀框的201位到220位；

SEQ?ID?No.4引物大小為20bp，結合于鴨TLR3開放閱讀框的420位到439位。

第三方面，本發明提供一種鴨的TLR3基因的熒光定量PCR檢測方法，所述檢測方法包括如下步驟：

步驟一、熒光定量PCR反應體系及條件的優化：以所述重組質粒pEASY-T5-zero-TLR3為模板，采用矩陣法篩選所述引物的最佳濃度，并對熒光定量PCR反應體系及反應條件進行優化；

步驟二、TLR3標準曲線的建立：以重組質粒pEASY-T5-duTLR3為標準品，測定其OD₂₆₀值；根據所述標準品的分子量與質量濃度，計算其拷貝濃度，稀釋，進行FQ-PCR擴增，以重組質粒pEASY-T5-duTLR3拷貝數的對數為X軸，循環次數(Ct)為Y軸，建立標準曲線；

步驟三、重復性驗證：對1.0×10³～10⁸拷貝/μL的重組質粒pEASY-T5-TLR3進行重復驗證，每次重復設若干濃度梯度，每個濃度梯度設有若干平行處理；

步驟四、敏感性驗證：以重組質粒pEASY-T5-TLR3為模板進行FQ-PCR檢測，同時設立陰性對照(NTC)；

步驟五、特異性驗證：通過樣品與所述標準品的序列比對及樣品的溶解曲線的峰型對檢測方法的特異性進行雙重驗證。