[發(fā)明專利]控制蘋果果肉有機酸含量的蘋果酸轉(zhuǎn)運體基因及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510061891.6
• 申請日: 2015-02-06
• 公開（公告）號: CN104561046B
• 公開（公告）日: 2017-08-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 韓月彭;馬百全;王魯;谷超
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院武漢植物園
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C07K14/415;C12Q1/68
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務(wù)所42001
• 代理人: 黃瑞棠

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及蘋果分子遺傳育種領(lǐng)域，尤其涉及一種控制蘋果果肉有機酸含量

的蘋果酸轉(zhuǎn)運體基因及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

蘋果是世界上種植與消費量最大的水果，具有高度雜合、自交不親和以及幼年期較長等特點。這些特點尤其是童期長嚴重制約著蘋果遺傳育種及新品種的培育工作。果實品質(zhì)直接決定果實的商業(yè)價值，并影響消費市場上的份額。果實中的酸、糖及香氣物質(zhì)等組分的含量是決定果實品質(zhì)的主要因素。蘋果的有機酸含量是其中影響口感品質(zhì)的重要因素，對消費市場份額、果汁加工品質(zhì)等方面具有重要的影響。

成熟果實中含有的主要有機酸是蘋果酸，約占總酸含量的90%以上。至今，人們采用正向和反向遺傳學(xué)方法對決定蘋果果實酸度的基因開展了許多研究。利用cDNA芯片對高酸、低酸等品種果實表達譜差異進行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NADP-ME和NAD-MDH可能是蘋果酸代謝途徑中的關(guān)鍵基因；也有研究認為NADP-ME是蘋果酸降解的關(guān)鍵基因，而PEPC是蘋果酸合成關(guān)鍵基因。但PEPC、NAD-MDH、NADP-ME等有機酸代謝相關(guān)基因的酶活在低酸蘋果品種‘Usterapfel’和其高酸突變體之間沒有差異；此外，利用番茄單片段漸滲系進行基因定位研究，鑒定的果實酸度QTLs區(qū)域都不包含酸代謝結(jié)構(gòu)基因，故可推斷蘋果酸代謝途徑中的結(jié)構(gòu)基因?qū)麑嵥岫炔黄饹Q定作用。

液泡是蘋果酸和檸檬酸主要貯藏場所。有機酸向液泡中轉(zhuǎn)運，需要多種轉(zhuǎn)運體和質(zhì)子泵之間的協(xié)同作用。在擬南芥中，液泡膜二羧酸轉(zhuǎn)運體（AttDT）和鋁誘導(dǎo)蘋果酸轉(zhuǎn)運體（AtALMT6和AtALMT9）都位于液泡膜上，分別起著蘋果酸轉(zhuǎn)運體和蘋果酸通道的功能，將它們敲除和過量表達后會造成葉片中蘋果酸的積累減少。蘋果等果樹中也包含這兩種轉(zhuǎn)運體基因。我們發(fā)現(xiàn)其中蘋果MdALMT9的轉(zhuǎn)錄本在果實酸度性狀有分離的群體中存在著表達量和序列的差異，可能與果實的酸度具有重要的聯(lián)系。

目前已經(jīng)有報道說存在著可能控制蘋果果實中蘋果酸含量的候選基因，但未能證實其功能機制。而且在本發(fā)明報道之前尚未有利用分子標記對自然群體中蘋果酸含量進行分析的報道。為了在蘋果果樹育種中克服具有高度雜合、自交不親和以及較長的幼年期的特點，本發(fā)明通過關(guān)聯(lián)分析獲得與果實中蘋果酸含量相關(guān)的候選基因，發(fā)展候選基因內(nèi)部的CAPS及下游的SSR標記，進行單倍體型與蘋果酸含量的相關(guān)分析，提出通過植株不同的單倍體型進行蘋果果樹的標記輔助選擇遺傳育種。同時本發(fā)明通過將該基因轉(zhuǎn)化到酵母中，驗證了該基因的存在能使液泡的pH值發(fā)生顯著變化，從而間接證明了其調(diào)節(jié)果肉酸度的功能。

分子遺傳學(xué)理論與技術(shù)應(yīng)用于農(nóng)作物育種的實踐并沒有很長時間，但已經(jīng)顯示了強大的技術(shù)潛力與廣闊的應(yīng)用前景。在早期發(fā)展中得到應(yīng)用的分子遺傳學(xué)技術(shù)主要是分子標記，育種研究通過尚不完善的分子標記技術(shù)構(gòu)建了很多遺傳連鎖圖譜，獲得了部分重要農(nóng)藝性狀的基因定位。隨著基因組學(xué)的理論和技術(shù)獲得提升，積累了越來越多的基因組序列和變異的數(shù)據(jù)，作物育種正在呈現(xiàn)全新的面貌。在果樹育種中，基于全基因組關(guān)聯(lián)分析和分子標記輔助選擇的強大技術(shù)平臺，使得育種者可以用之前難以想象的速度深入挖掘重要基因，并完成分子育種和分子設(shè)計，標記輔助選擇大大加快了果樹的育種進程。

本發(fā)明就是基于這些新技術(shù)的果樹分子育種的實踐，獲得了之前從未能得到的果肉酸度控制基因。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺點和不足，提供一種控制蘋果果

肉有機酸含量的蘋果酸轉(zhuǎn)運體基因及其應(yīng)用。

本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的：

一、控制蘋果果肉有機酸含量的蘋果酸轉(zhuǎn)運體基因（MdAlMT9）

蘋果果肉的主要有機酸是蘋果酸，本發(fā)明參考以前的育種研究者對蘋果果肉酸含量進行QTL（數(shù)量性狀遺傳）定位的結(jié)果，通過遺傳學(xué)方法，借助本申請人之前構(gòu)建的BAC（細菌人工染色體）文庫，用染色體步進的方法逼近該基因，最終克隆獲得了一個能決定蘋果果肉酸含量的基因，即前述的MdAlMT9蘋果酸轉(zhuǎn)運體基因，其序列見SEQ ID NO.1和NO.2。

具體的說：

通過HPLC（高效液相色譜）確定作圖群體的成熟蘋果果肉中有機酸的含量與組分；通過Q-PCR（熒光定量實時PCR）和race（RNA末端快速克隆）等方法確定有機酸代謝和轉(zhuǎn)運過程的關(guān)鍵基因的序列全長以及在蘋果果實成熟過程中的表達模式。