[發(fā)明專利]一種精子細(xì)胞轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)基因的基因檢測(cè)方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510061386.1
• 申請(qǐng)日: 2015-02-06
• 公開（公告）號(hào): CN104630362A
• 公開（公告）日: 2015-05-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 毛丹丹;王校;張奕
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海中優(yōu)醫(yī)藥高科技有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

1.一種精子細(xì)胞轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)基因檢測(cè)方法，其特征在于，具體步驟為

步驟1：檢測(cè)的樣品類型與采樣方法

用采樣拭在口腔中分別左右兩腮至少需要各上下刮40次以上，以保證采集到足量的細(xì)胞樣本；

步驟2：基因組DNA的抽提方法

采用硅膠吸附法抽提每一個(gè)口腔上皮細(xì)胞樣本的基因組DNA，時(shí)間為2小時(shí)－2.5小時(shí)，經(jīng)電泳檢測(cè)后，用肉眼可見清晰白色條帶即可判斷獲得的DNA能進(jìn)入下一步檢測(cè)；

步驟3：熒光定量PCR反應(yīng)

將每一個(gè)被測(cè)者樣本分別放入2個(gè)反應(yīng)孔，同時(shí)檢測(cè)2個(gè)位點(diǎn)，即一氧化氮合酶(NOS3)?rs1799983，TNF-α家族成員Fas配體基因(FASLG)?rs763110，另外根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要增設(shè)不含DNA模版的NTC空白對(duì)照孔；

每一個(gè)反應(yīng)孔的基因分型可以根據(jù)下表的引物和探針設(shè)計(jì)，采用TaqMan?-MGB技術(shù)，進(jìn)行檢測(cè)試劑合成；

在每一個(gè)反應(yīng)孔中加入試劑為熒光定量PCR反應(yīng)體系，總體積為10μl，即濃度為20ng/μl?的DNA模板2μl?、1μl?10X熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液ABI?Taqman???MGB、0.1μl?25mM?d?NTP合成DNA的四種脫氧核苷酸底物、0.5μl?25mM?MgCl₂溶液、0.02μl（5units/μl）Taq?DNA聚合酶、去離子水4.98μl、3個(gè)位點(diǎn)分別采用不同的正向引物（20μM，0.225μl）、反向引物（20μM，0.225μl）、VIC熒光探針（10μM，0.25μl）和FAM熒光探針（10μM，0.25μl）工具進(jìn)行檢測(cè)，其引物探針如下：

帶VIC熒光A型探針???TGAgCCCCCAGAA

帶FAM熒光G型探針???TGAtCCCCCAGAA

正向引物???CTCCCCACAGCTCTGCAT

反向引物???CAGTCAATCCCTTTGGTGCT

帶VIC熒光C型探針???TTGcGAAATACAA

帶FAM熒光G型探針???TTGtGAAATACAA

正向引物???GATAGCACCACTGCACTCCA

反向引物???TCATCTCTTCCCCACACACA

將反應(yīng)孔和空白對(duì)照在PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng)，先進(jìn)行預(yù)熱：50℃、2分鐘，95℃、10分鐘，然后再進(jìn)行60個(gè)循環(huán)的95℃、30秒，60℃、1分鐘、反應(yīng)結(jié)束后取出后再放入熒光定量PCR儀上讀取樣品熒光量，得到一氧化氮合酶(NOS3)?rs1799983，TNF-α家族成員Fas配體基因(FASLG)?rs763110兩張圖；

步驟4：SNP基因型分析

將熒光定量PCR儀上顯示的最終樣本熒光信號(hào)的3個(gè)圖和一個(gè)NTC空白對(duì)照進(jìn)行比較，每個(gè)位點(diǎn)理論上存在三種不同的信號(hào)，純VIC熒光信號(hào)、VIC和FAM雜合熒光信號(hào)以及純FAM熒光信號(hào)，分別代表該位點(diǎn)三種不同的基因型；

（1）、一氧化氮合酶(NOS3)?rs1799983

在檢測(cè)結(jié)果圖中，坐標(biāo)軸左下區(qū)域?yàn)榭瞻讓?duì)照、坐標(biāo)軸左上區(qū)域?yàn)镚G基因型、坐標(biāo)軸右上區(qū)域?yàn)镚T基因型、坐標(biāo)軸右下區(qū)域?yàn)門T基因型，

（2）、TNF-α家族成員Fas配體基因(FASLG)?rs763110

在檢測(cè)結(jié)果圖中，坐標(biāo)軸左下區(qū)域?yàn)榭瞻讓?duì)照、坐標(biāo)軸左上區(qū)域?yàn)镃C基因型、坐標(biāo)軸右上區(qū)域?yàn)镃T基因型、坐標(biāo)軸右下區(qū)域?yàn)門T基因型。

2.權(quán)利要求書1中的所述的NOS3基因與FASLG基因的組合檢測(cè)模式。