[發明專利]一種快速檢測甘蔗屬SPSB基因多態性的方法及應用

有效

• 申請號: 201510060627.0
• 申請日: 2015-02-05
• 公開（公告）號: CN104561364A
• 公開（公告）日: 2015-04-29
• 發明（設計）人: 劉洪博;劉新龍;范源洪;蔡青;陸鑫;毛鈞;徐超華;李旭娟;蘇火生;馬麗
• 申請（專利權）人: 云南省農業科學院甘蔗研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 昆明正原專利商標代理有限公司 53100
• 代理人: 陳左

技術領域

本發明屬于植物分子育種技術領域，具體涉及一種檢測甘蔗SPSB基因(JN 584485)多態性的方法，及其在甘蔗糖分性狀的標記輔助選擇育種中快速建立遺傳優良的甘蔗種質的應用。

背景技術

甘蔗屬(Saccharum)包含熱帶種(Saccharum.officinarum L.)、中國種(Saccharum sinense R.)、印度種(Saccharum barberi J.)、甘蔗大莖野生種(Saccharum robustum B.)和甘蔗細莖野生種(Saccharum spontaneum L.)，是甘蔗雜交育種中常用的甘蔗資源，染色體復雜多變，多為異源多倍體植物，細胞核內含有多套染色體組。因此雜交后代的性狀分離嚴重，一個雜交花穗的后代有成百上千后代類型，不能精確各單倍型在后代的傳遞方式。蔗糖磷酸合成酶(SPS)是甘蔗蔗糖合成最關鍵的酶之一，鑒定和分離出不同多態性的SPS基因對甘蔗的定向雜交與提高甘蔗蔗糖分具有重要的意義。目前，我國甘蔗育種還基本上以傳統的雜交為主，從不同的雜交組合中選出性狀優良的，高產高糖的品種。但這一方式耗費時間長，育成一個品種至少需要6年以上的時間，而且在選配雜交組合時僅從表型性狀來選擇父母本，加上甘蔗開花條件的限制，育成一個新品種的難度很大，因此如何從分子水平來指導甘蔗的品種選育成為育種家們關注的焦點。

甘蔗是我國重要的糖料作物，提高單位面積內甘蔗產量是甘蔗育種家們一直追求的目標。蔗糖磷酸合成酶是甘蔗蔗糖合成最密切的關鍵酶之一，共有4個家族，它是甘蔗體內光合產物向蔗糖和淀粉分配的關鍵調控點，在該酶的作用下，不可逆性的催化六磷酸果糖生成六磷酸蔗糖，此產物在蔗糖磷酸酯酶的作用下形成蔗糖，與蔗糖的合成呈正相關，對甘蔗蔗糖含量的增加具有重要的作用。因此，分析SPS基因遺傳變異特別是多態位點與甘蔗糖分性狀的關聯程度，對培育具有優良性狀的甘蔗新品種和提高育種速度具有重要的理論指導意義。

目前國內外在甘蔗SPSB基因的克隆和功能方面的研究較多，主要從mRNA的角度來進行研究，但該基因的內含子區域并沒有得到完整的克隆，其內含子區域的多態性分析也未見報道。雖然內含子不能決定基因的表達功能，但內含子的多態性可以區分不同倍性的SPS基因及其來源。

發明內容

本發明解決的問題在于利用甘蔗屬不同種基因組DNA來篩查SPSB基因的多態性，尋找插入性片段作為PCR檢測的位點，從而提供一種快速檢測甘蔗屬SPSB基因多態性的方法，并以此作為甘蔗多態性的標記，為不同SPSB基因型的甘蔗雜交育種提供一定的指導。

本發明采用的技術方案如下：

一種快速檢測甘蔗屬SPSB基因多態性的方法，其特征在于，設計一對引物SPSB2177P2擴增含多態的DNA片段，經瓊脂糖凝膠電泳檢測，依據獲得的電泳圖譜條帶類型判斷SPSB基因多態類型，

包括如下步驟：

步驟(1)，模板的制備：提取被測樣本的基因組DNA；

步驟(2)，引物設計：所述的引物對SPSB2177P2為：

上游引物：5’–TGACGACAATAAGGAGAAGAA–3’

下游引物：5’–CAAAGGAACAGCTAGTGAAAC–3’

步驟(3)，PCR擴增和瓊脂糖凝膠電泳檢測；

步驟(4)，基因型的判斷；

步驟(5)，SPSB基因多態結果鑒定。

上述技術方案中，所述的模板為甘蔗屬大莖野生種51NG3、印度種Nagori、甘蔗品種ROC22、熱帶種Badila、中國種光澤竹蔗和甘蔗細莖野生種印割1號的DNA。

上述技術方案中，所述的PCR擴增體系為：

上述技術方案中，所述的擴增程序為94℃預變性5min；35個循環94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s；72℃延伸7min。

所述的瓊脂糖凝膠電泳檢測的具體方法如下：配2.5％(w/v)瓊脂糖凝膠，取5μL擴增的產物與2μLLoading buffer混勻后上樣，140V下電泳30min，紫外判斷PCR結果。具體結果如圖1所示，甘蔗栽培種ROC22、熱帶種Badila、中國種光澤竹蔗、印度種Nagori和大莖野生種51NG3同時含有C1和C2型，而甘蔗細莖野生種印割1號僅含有C1型，表現為C2缺失型。