[發明專利]壞死梭桿菌血凝素相關外膜蛋白基因完整的核苷酸序列及其克隆方法

有效

• 申請號: 201510055420.4
• 申請日: 2015-02-03
• 公開（公告）號: CN104673806B
• 公開（公告）日: 2019-01-08
• 發明（設計）人: 吳洪超;馮二凱;陳立志;彭風華;閆喜軍;吳威;劉曉穎;程世鵬
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院特產研究所;吉林特研生物技術有限責任公司
• 主分類號: C12N15/31
• 分類號: C12N15/31;C12N15/10;C07K14/415
• 代理公司: 長春菁華專利商標代理事務所(普通合伙) 22210
• 代理人: 王丹陽

1.壞死梭桿菌血凝素相關外膜蛋白基因，其特征在于，該基因的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO:6所示；

所述核苷酸序列編碼的氨基酸序列如序列表中的SEQ ID NO:7所示；

所述核苷酸序列通過染色體步移方法克隆得到。

2.如權利要求1所述的壞死梭桿菌血凝素相關外膜蛋白基因的克隆方法，其特征在于，該方法的條件和步驟如下：

步驟一、采用染色體步移方法對壞死梭桿菌血凝素相關外膜蛋白基因未知序列進行克隆和測序

(1)根據公布號為AF529887.1的壞死梭桿菌血凝素相關外膜蛋白基因部分核苷酸序列，設計引物：

SP1：5'-GCCCCGACTTTGATGTTTCCACTACT-3'，

SP2：5'-GCGGGCGGTTCAAATGTTACAGTTCC-3'，

SP3：5'-CCGCCGTCGTATTCTTAACTGCCGTTA-3'，

SP4：5'-CGCCCCAGACGGATTGGAACAACGAT-3'，

SP5：5'-GGCGGGGAAGAATGGGATACCAAGTC-3'，

SP6：5'-CGCAACGGATACTGCTGGAGTCATGG-3'；

(2)以壞死梭桿菌AB型菌株的基因組DNA為模板，Genome Walking kit中的簡并引物AP1、AP2、AP3、AP4分別為上游引物，SP1為第一輪PCR的下游引物，SP2為第二輪PCR的下游引物，SP3為第三輪PCR的下游引物，經過三輪PCR擴增壞死梭桿菌血凝素相關外膜蛋白基因5'端未知序列，第一輪PCR擴增的反應體系總體積為50μL，包括1μL壞死梭桿菌AB型菌株的基因組DNA，8μL濃度為2.5mmol/Leach的dNTPs Mixture，5μL含Mg²⁺plus的10×LAPCR Buffer，0.5μL濃度為5U/μL的LATaq，1μL濃度為100pmol/μL的上游引物，1μL濃度為10pmol/μL的下游引物，33.5μLddH₂O；第二輪PCR擴增的反應體系總體積為50μL，包括1μL第一輪PCR擴增產物，8μL濃度為2.5mmol/Leach的dNTPs Mixture，5μL含Mg²⁺plus的10×LAPCR Buffer，0.5μL濃度為5U/μL的LATaq，1μL濃度為100pmol/μL的上游引物，1μL濃度為10pmol/μL的下游引物，33.5μLddH₂O；第三輪PCR擴增的反應體系總體積為50μL，包括1μL第二輪PCR擴增產物，8μL濃度為2.5mmol/L each的dNTPs Mixture，5μL含Mg²⁺plus的10×LAPCR Buffer，0.5μL濃度為5U/μL的LATaq，1μL濃度為100pmol/μL的上游引物，1μL濃度為10pmol/μL的下游引物，33.5μLddH₂O；PCR反應條件見表1；膠回收目的片段，連接pMD18-T載體，連接產物轉化E.coli Trans T1感受態細胞，通過藍白斑篩選陽性克隆，對PCR鑒定為陽性的菌液進行測序，測序后拼接為1248bp的核苷酸序列，如序列表中的SEQ ID NO:1所示；

表1

(3)以壞死梭桿菌AB型菌株的基因組DNA為模板，SP4為第一輪PCR的上游引物，SP5為第二輪PCR的上游引物，SP6為第三輪PCR的上游引物，Genome Walking kit中的簡并引物AP1、AP2、AP3、AP4分別為下游引物，經過三輪PCR擴增壞死梭桿菌血凝素相關外膜蛋白基因3'端未知序列，第一輪PCR擴增的反應體系總體積為50μL，包括1μL壞死梭桿菌AB型菌株的基因組DNA，8μL濃度為2.5mmol/L each的dNTPs Mixture，5μL含Mg²⁺plus的10×LAPCR Buffer，0.5μL濃度為5U/μL的LATaq，1μL濃度為100pmol/μL的上游引物，1μL濃度為10pmol/μL的下游引物，33.5μLddH₂O；第二輪PCR擴增的反應體系總體積為50μL，包括1μL第一輪PCR擴增產物，8μL濃度為2.5mmol/L each的dNTPs Mixture，5μL含Mg²⁺plus的10×LAPCRBuffer，0.5μL濃度為5U/μL的LATaq，1μL濃度為100pmol/μL的上游引物，1μL濃度為10pmol/μL的下游引物，33.5μLddH₂O；第三輪PCR擴增的反應體系總體積為50μL，包括1μL第二輪PCR擴增產物，8μL濃度為2.5mmol/L each的dNTPs Mixture，5μL含Mg²⁺plus的10×LA PCR Buffer，0.5μL濃度為5U/μL的LA Taq，1μL濃度為100pmol/μL的上游引物，1μL濃度為10pmol/μL的下游引物，33.5μLddH₂O；PCR反應條件見表2；膠回收目的片段，連接pMD18-T載體，連接產物轉化E.coli Trans T1感受態細胞，通過藍白斑篩選陽性克隆，對PCR鑒定為陽性的菌液進行測序，測序后拼接為1023bp的核苷酸序列，如序列表中的SEQ ID NO:2所示；

表2

步驟二、壞死梭桿菌血凝素相關外膜蛋白基因未知序列的驗證

(1)根據步驟一的測序結果，設計引物：

j1：5'-TAGTCGAGTGAGATGAAGCAAGCGGAG-3'，

j2：5'-CCCGCCGAGTGAGATGAAACGAGTAC-3'；

(2)壞死梭桿菌血凝素相關外膜蛋白基因5'端未知序列的驗證

以壞死梭桿菌AB型菌株的基因組DNA為模板，j1為上游引物，SP3為下游引物，采用高保真的FastPfu DNA聚合酶進行PCR擴增壞死梭桿菌血凝素相關外膜蛋白基因的5'端未知序列；PCR反應體系總體積為50μL，包括2μL模板，2μL濃度為10μmol/L的上游引物，2μL濃度為10μmol/L的下游引物，10μL 5×TransStart FastPfu Buffer，5μL濃度為2.5mmol/L each的dNTPs Mixture，1μL高保真的FastPfu DNA聚合酶，28μL ddH₂O；PCR反應條件：95℃預變性3min，94℃變性30s，61℃退火30s，72℃延伸50s，30次循環，72℃延伸10min，4℃終止反應；膠回收目的片段，連接pEASY-Blunt載體，連接產物轉化E.coli Trans T1感受態細胞，對PCR鑒定正確的菌液進行測序，測序后拼接為1248bp的核苷酸序列，如序列表中的SEQ IDNO:3所示；

(3)壞死梭桿菌血凝素相關外膜蛋白基因3'端未知序列的驗證

以壞死梭桿菌AB型菌株的基因組DNA為模板，SP6為上游引物，j2為下游引物，采用高保真的FastPfu DNA聚合酶進行PCR擴增壞死梭桿菌血凝素相關外膜蛋白基因的3'端未知序列，PCR反應體系總體積為50μL，包括2μL模板，2μL濃度為10μmol/L的上游引物，2μL濃度為10μmol/L的下游引物，10μL 5×TransStart FastPfu Buffer，5μL濃度為2.5mmol/L each的dNTPs Mixture，1μL高保真的FastPfu DNA聚合酶，28μL ddH₂O，PCR反應條件：95℃預變性3min，94℃變性30s，62℃退火30s，72℃延伸50s，30次循環，72℃延伸10min，4℃終止反應；膠回收目的片段，連接pEASY-Blunt載體，連接產物轉化E.coli Trans T1感受態細胞，對PCR鑒定正確的菌液進行測序，測序后拼接為1000bp的核苷酸序列，如序列表中的SEQ IDNO:4所示；

(4)經過驗證的壞死梭桿菌血凝素相關外膜蛋白基因5'端未知序列與3'端未知序列的拼接與分析

經過驗證的壞死梭桿菌血凝素相關外膜蛋白基因5'端未知核苷酸序列總長度為1248bp，與公布號為AF529887.1的壞死梭桿菌血凝素相關外膜蛋白基因部分核苷酸序列重疊174個堿基，經過驗證的壞死梭桿菌血凝素相關外膜蛋白基因3'端未知核苷酸序列總長度為1000bp，與公布號為AF529887.1的壞死梭桿菌血凝素相關外膜蛋白基因部分核苷酸序列重疊272個堿基，根據重疊的核苷酸序列，將經過驗證的壞死梭桿菌血凝素相關外膜蛋白基因5'端未知核苷酸序列、公布號為AF529887.1的壞死梭桿菌血凝素相關外膜蛋白基因部分核苷酸序列和經過驗證的壞死梭桿菌血凝素相關外膜蛋白基因3'端未知核苷酸序列拼接在一起，得到總長度為4247bp的核苷酸序列，如序列表中的SEQ ID NO:5所示；

利用NCBI在線工具預測4247bp核苷酸序列的開放閱讀框，預測結果為4247bp核苷酸序列中含有從ATG到TAA共3372bp的開放閱讀框，該壞死梭桿菌血凝素相關外膜蛋白基因完整的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO:6所示，編碼的1123個氨基酸序列如序列表中的SEQID NO:7所示。