[發明專利]一種負載細胞三維支架的制備方法及應用

有效

• 申請號: 201510045823.0
• 申請日: 2015-01-29
• 公開（公告）號: CN104548208B
• 公開（公告）日: 2016-10-26
• 發明（設計）人: 王紅;張楠
• 申請（專利權）人: 青島尤尼科技有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;A61L27/38;A61L27/24;A61L27/22;A61L27/20
• 代理公司: 青島聯智專利商標事務所有限公司 37101
• 代理人: 崔濱生

技術領域

本發明屬于細胞打印和生物材料技術領域，特別適用于生物醫學組織工程支架材料的制備，具體為一種制備負載細胞三維支架的方法。

背景技術

生命科學、信息科學與制造科學相結合，是二十一世紀科技發展的重要趨勢?；谙冗M制造理論和組織工程理論的細胞三維打印技術，為組織工程學、病理模型構建、藥物篩選與檢測、細胞生物學研究等領域拓展了新的理論和技術空間。

與傳統組織工程方法相比，細胞打印的優勢主要有：(1) 同時構建有生物活性的二維或三維“細胞/材料”體系；(2) 在時間和空間上準確沉積不同種類的細胞；(3) 構建細胞所需的三維微環境。細胞打印輸出技術主要包括噴墨打印（壓電容積驅動式和熱氣泡式）、激光直寫、激光誘導轉移、靜電噴射、聚焦超聲波噴射、微擠出等，傳統細胞打印的可行性和可靠性方面均已得到驗證, 但在如何保持細胞活性方面還有局限性：打印時，大多數哺乳動物細胞較為脆弱，易受到環境的影響，而在打印過程中噴嘴的最高溫度在300℃以上，且存在著較大的剪切應力，在細胞打印過程中產生瞬間高溫、高壓或瞬間強靜電場對細胞造成了傷害。因此制備具有合適孔隙結構且厚度大于300 μm的負載細胞三維支架時，在打印過程中保持細胞活性，減少對其生物學特性的不利影響是亟待解決的問題。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種基于細胞打印輸出技術制備負載細胞三維支架的方法，具有保持細胞活性的特點。

一種負載細胞三維支架的制備方法，是將自體細胞與高溫間歇滅菌的水凝膠溶液混合均勻得到混合液，噴射到交聯劑溶液中，靜置，然后去除交聯劑溶液，漂洗后得到負載細胞微球體；將負載細胞微球體與基質材料混合得到細胞共混物；采用生物打印機將細胞共混物擠出在三維微動平臺上，層層疊加，形成負載細胞三維支架。

進一步的，所述水凝膠溶液為水凝膠單體和水凝膠溶劑混合均勻配制而成，濃度為0.05-10 wt%；所述水凝膠單體為膠原、明膠、透明質酸、殼聚糖或海藻酸納中的一種或幾種的混合物；所述水凝膠溶劑為水或pH值為5.7-8.0的磷酸鹽緩沖溶液。

進一步的，所述混合液中自體細胞的濃度為10⁵-10⁷/mL。

進一步的，所述噴射的壓力為10-200 kPa，噴頭直徑為500-1000 μm。

進一步的，所述交聯劑溶液為CaCl₂溶液，濃度為0.1-20 wt%。

進一步的，所述的自體細胞為骨髓間充質干細胞、脂肪干細胞、軟骨細胞、成骨細胞中的一種或幾種組合。

進一步的，所述漂洗是先用PBS溶液漂洗3遍，然后使用DMEM培養液漂洗3遍。

進一步的，所述基質材料的制備方法為：分別配制重組膠原溶液和海藻酸鈉溶液，按質量比1:1-5混合，高溫間歇滅菌，所述重組膠原溶液的濃度為2-10 wt %，所述海藻酸鈉溶液的濃度為2-10 wt %；配置濃度為0.05- 2 wt %的CaCl₂溶液，將重組膠原-海藻酸鈉混合液與CaCl₂溶液按體積比7:3混合均勻，得到基質材料。

進一步的，所述細胞共混物中負載細胞微球體的濃度為10⁵-10⁷/mL。

所述負載細胞三維支架用于制備組織工程支架。

與現有技術相比，本發明的優點和積極效果是：本發明通過采用與細胞外基質成分類似的水凝膠材料對細胞進行包裹，能夠有效減少打印過程中的機械和熱環境對細胞造成的損傷。本發明通過將細胞與水凝膠混合溶液噴射到CaCl₂溶液中的方法，制備得到負載細胞的微球體，水凝膠材料的包裹可對細胞形成保護，減輕細胞打印過程對細胞活性及生物活性造成的損害，保證高活性的細胞打印。本發明所用的種子細胞為自體細胞，無免疫排斥。本發明能根據人體組織或器官的不同需要，調整打印參數，能直接制備具有各種結構（多孔、管狀）和力學性能的三維支架，用于組織工程和再生醫學研究。本發明方法簡單，易于操作，成本低，能三維成型具有復雜形態的支架，能滿足臨床需要，適合于工程支架的制備。

附圖說明

圖1. 本發明負載細胞三維支架的制備方法流程圖；

圖2. 本發明的負載細胞微球體的顯微觀察圖；

圖3. 本發明的負載細胞三維支架結構圖；

圖4. 本發明中實施例1所述支架細胞活性檢測染色結果。

具體實施方式