[發明專利]一種適用于氧化葡萄糖酸桿菌的基因表達載體及其應用

有效

• 申請號: 201510042193.1
• 申請日: 2015-01-27
• 公開（公告）號: CN104513830B
• 公開（公告）日: 2017-08-11
• 發明（設計）人: 林金萍;魏東芝;石園園;李克非
• 申請（專利權）人: 華東理工大學
• 主分類號: C12N15/74
• 分類號: C12N15/74;C12N1/21;C12R1/01
• 代理公司: 上海智信專利代理有限公司31002
• 代理人: 鄧琪

技術領域

本發明涉及生物技術領域，更具體地涉及一種適用于氧化葡萄糖酸桿菌的基因表達載體及其應用。

背景技術

質粒作為應用最廣泛的基因表達載體，可幫助外源基因轉入受體細胞，并為其提供在受體細胞中的復制或整合能力及擴增與表達能力。質粒是細菌中一種獨立于染色體之外的可自主復制的雙鏈環狀DNA分子，它含有獨特的復制起始位點(ori)，有的還含有特定的復制子結構(replicon)，質粒的拷貝數與它的復制結構息息相關。

氧化葡萄糖酸桿菌(G.oxydans)含有多種膜結合脫氫酶，可不完全氧化醇、醛等化合物生成相應的醛、酮和酸，其獨特的不完全氧化特性使得它具有廣泛的工業應用價值。利用基因重組技術在氧化葡萄糖酸桿菌中過表達脫氫酶基因，可在很大程度上增加單位質量菌體的酶活，提高相關產物的合成效率。目前，廣泛用于G.oxydans基因表達的質粒主要是廣宿主質粒pBBR1MCS系列，但是該質?？截悢递^低。近來，少數研究者報導了基于廣宿主質粒pBBR1MCS或G.oxydans內源性質粒而改造的質粒。例如，Verena等人將編碼G.oxydans核糖體蛋白L35和L13的基因的啟動子區域整合到廣宿主質粒pBBR1MCS-2中，構建了強啟動子載體pBBR1p264和中等強度啟動子載體pBBR1p452，有利于滿足不同程度蛋白表達水平的要求(參見VerenaKallnik,Maria Meyer,UweDeppenmeier,Paul Schweiger.Construction of expression vectors for proteinproduction in Gluconobacteroxydans.Journal of Biotechnology,2010,150:460-465.)。本發明人曾以G.oxydans內源性質粒pGOX3為基礎，構建了基因表達質粒pZL1。該質粒包含了pGOX3中與質粒分配有關的par基因和與復制有關的rep基因，以及質粒PUC19的氨芐抗性基因和復制起始區origin，因而該質粒在大腸桿菌及氧化葡萄糖酸桿菌中均可自主復制(參見Lin Zhang,Jinping Lin,Yushu Ma,Dongzhi Wei,Ming Sun.Construction of a Novel Shuttle Vector for Use in Gluconobacteroxydans.MolBiotechnol,2010,46:227-233.)。然而，這些質粒在G.oxydans中的拷貝數普遍較低，這大大限制了G.oxydans的工業應用潛能及科學研究進程。

發明內容

本發明的目的是提供一種適用于氧化葡萄糖酸桿菌的基因表達載體及其應用，從而解決現有技術中的質粒在氧化葡萄糖酸桿菌中的拷貝數普遍較低，導致氧化葡萄糖酸桿菌的工業應用受到限制的缺陷。

為了解決上述技術問題，本發明采用以下技術方案：

提供一種適用于氧化葡萄糖酸桿菌的基因表達載體，所述基因表達載體是：1)將質粒pBBR1MCS-5中的rep基因啟動子-35區“TTGACT”序列定點突變為“TTGACA”序列得到的質粒(即將序列1689bp處的堿基T替換為堿基A得到的質粒)，或將質粒pBBR1MCS-5中的rep基因啟動子-10區“CATAAT”序列定點突變為“TATAAT”序列得到的質粒(即將序列1707bp處堿基C替換為堿基T得到的質粒)，或以上兩處均定點突變得到的質粒，其中，所述質粒pBBR1MCS-5序列如SEQ ID NO：1所示；或2)其他以pBBR1MCS質粒為基礎的、且與pBBR1MCS質粒具有相同的rep基因作為復制起始區的質粒發生與1)相同的堿基替換所得到的質粒。

本發明所提供的基因表達載體以廣泛用于氧化葡萄糖酸桿菌基因工程菌構建的質粒pBBR1MCS-5或以pBBR1MCS質粒為基礎的衍生質粒為骨架，將其與復制有關的rep基因啟動子的-35區和-10區分別突變為保守序列“TTGACA”和“TATAAT”，從而增強該啟動子的強度，以增加rep基因的表達量，進而提高質粒的拷貝數。

所述衍生質粒包括所有以pBBR1MCS質粒為基礎的、且與pBBR1MCS質粒具有相同的rep基因作為復制起始區的質粒。